Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

30 MATERIAL UNDMETHODEN
NaOH-Plätzchen auf pH 7,5 eingestellt) gelöst ; 0,1 % (w/v) N-Lauroylsarcosin ; 0,02 % (w/v)
SDS) versetzt und die Röhren 2 - 4 Stunden bei 68°C so langsam wie möglich im
Hybridisierungsofen (Shake 'n' Stack, Thermo Life Sciences, Egelsbach) gedreht . Die
Digoxigenin-markierte Sonde, von der 20-50 ng/ml Hybridisierungslösung
(Prähybridisierungslösung + Sonde) eingesetzt wurden, wurde vor Gebrauch denaturiert
(10 min, 95°C) . Die Hybridisierung erfolgte ÜN bei 68°C . Die Hybridisierungslösung mit der
Sonde wurde für eine spätere Wiederverwendung eingefroren . Vor der Detektion wurde die
Membran 2 x 5 min in 50 ml 2 x SSC bei RT und 2 x 15 min in 50 ml 0,1 x SSC bei 68°C
gewaschen, anschließend kurz in Maleinsäurepuffer gewaschen und 30 min in 80 ml
Blockierungslösung inkubiert (bei Raumtemperatur) . Danach erfolgte eine 30-minütige
Inkubation mit der Antikörperlösung (1 :10000 Verdünnung des Antikörpers (Anti-Digoxigin-
alkalische Phosphatase-Konjugat, Roche Diagnostics, Mannheim) mit Blockierungsreagenz) .
Anschließend wurde die Membran 2 x 15 min mit 80 ml/100 cm2 Waschpuffer
(Maleinsäurepuffer mit 0,3 % (v/v) Tween°20) gewaschen und 5 min in Detektionspuffer
(0,1 M Tris, 0,1 M NaCI, pH 9,5) äquilibriert. Zur Detektion wurde der Blot in eine
Plastikfolie gelegt und auf die DNA-Seite 25 Tropfen/100 cm 2 CDP-Star-ready-to-use-
Lösung (Roche Diagnostics, Mannheim) aufgetropft . Nach ca . 5 min Inkubation wurde das
Fluoreszenzsignal mit einer CCD-Kamera detektiert . Zur Größenbestimmung von DNA-
Fragmenten wurde die AIDA-Software (Version 2.0, Raytest Isotopenmeßgeräte GmbH,
Straubenhardt) eingesetzt.
7 Biochemische Methoden
7 .1 Zellaufschluß und -fraktionierung
Für den Aufschluss von Zellen wurden diese in 10 ml TE-Puffer resuspendiert (4 ml
Puffer/g Feuchtzellen) . Als Proteaseinhibitor diente Phenylmethylsulfonyl-Fluorid (PMSF),
das in einer Konzentration von 2 mM eingesetzt wurde . Zum Abbau der DNA wurde
außerdem 0,25 mg/ml DNase 1 hinzugefügt . Der Zellaufschluß erfolgte durch dreimalige
Passage durch eine French-Press-Zelle (SLM AMINCO
Spectronic Instruments,
Heinemann, Schwäbisch Gmünd) bei einem Druck von 108 MPa . Anschließend wurden
intakte Zellen sowie große Zelltrümmer durch Zentrifugation (30 min, 27000 g, 4°C)
abgetrennt . Danach erfolgte eine Ultrazentrifugation des zellfreien Überstandes (90 min,