Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

70 ERGEBNISSE
0 .5 -
0 .4 -
0.1 -
0.0 -
0
0 20 40 60 80 100
Fluoropyruvat, Bromopyruvat [mM]
Abb. 23 : Vergleich der maximalen Wachstumsraten (gmax) von E. coli MG1655 bei Wachstum auf
Glucose-Minimalmedium mit verschiedenen Konzentrationen Fluoropyruvat (" ) bzw . Bromopyruvat
Zur Transposon-Mutagenese wurde das Plasmid pKNG101-Tn5 konstruiert, dass ein Tn5-
tragendes 8,0-kb-Apal-Fragment aus pRJ3405 im Vektor pKNG101 trägt . Dieser Vektor kann
in E. coli nicht replizieren, außer in eigens dafür konstruierten Stämmen, die das Pir-Protein
bilden . Das Plasmid pKNG101-Tn5 wurde mittels Elektroporation in E. coli MG1655
transferiert und die transformierten Zellen auf LB-Platten mit Kanamycin (15 lag/ml)
selektioniert . Die so erhaltenen 26000 Transposon-Mutanten wurden auf Minimalmedium-
Platten mit 50 mM Glucose, 5 mM Bromopyruvat und 15 lag/ml Kanamycin überimpft,
jedoch konnte keine einzige Mutante unter diesen Bedingungen wachsen. E. coli hat
4400 Gene, die 26000 getesteten Kolonien entsprachen somit ungefähr einer sechsfachen
Abdeckung. Unter der Voraussetzung, dass die Transposon-Insertionen ungerichtet waren,
sollte jedes Gen mit einer Wahrscheinlichkeit von 99,9 % getroffen worden sein . Eine
mögliche, wenn auch eher unwahrscheinliche Erklärung für das Nicht-Wachstum aller
Transposon-Mutanten könnte sein, dass das gesuchte Pyruvat-Importer-Gen unter den
getesteten Bedingungen essentiell ist . Andererseits könnten auch die experimentellen
Bedingungen allein Ursache für das negative Ergebnis sein . Um die zur vollständigen
Wachstumshemmung notwendige Bromopyruvat-Heininkonzentration genauer zu bestimmen,
wurde das Wachstum von MG1655 auf Glucose-Minimalmedium-Platten mit 0, 0,1, 0,2, 0,5,
1, 1,25, 1,6, 2, 2,5 sowie 4 mM Bromopyruvat überprüft. Dabei zeigte sich, dass bereits eine
Konzentration von 2 mM für eine vollständige Inhibierung des Wachstums ausreichend war .
Es wurden weitere Transposon-Mutagenesen durchgeführt, bei denen die Selektion direkt
auf LB-Platten mit 15 ~tg/ml Kanamycin und 2 mM oder 3 mM Bromopyruvat erfolgte oder