Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

ERGEBNISSE 67
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15
10
5
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B.
+ 100 pM CCCP
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Zeit (h) Zeit (h)
Abb . 21 : Einfluss von 100 pM CCCP auf die Glucose-Umsetzung (") und die Pyruvat-Produktion (A)
durch ruhende YYC2021dhA-Zellen in einem Puffergemisch (je 50 mM MES, MOPS, Tricine) bei pH 6
mit 10 mM Glucose . Nach 2 Stunden Inkubation bei 3TC und 140 U .p.m . wurde 100 pM CCCP (B .)
bzw . ein entsprechendes Volumen Ethanol (A ., 250 pl) zugesetzt. Die OD600 der Zellsuspension
betrug jeweils 1,3 .
6 .2 .4 Einfluss von Trichlordiphenylharnstoff auf den Pyruvat-Export
Die protonenmotorische Kraft setzt sich aus zwei Komponenten zusammen, der chemischen
(OpH) und der elektrischen Potentialdifferenz (Ayf) . Ob der Pyruvat-Export nach dem Abbau
des pH-Gradienten zum Erliegen kommt, wurde mit Trichlordiphenylharnstoff (TCC)
überprüft . TCC ist ein Ionophor, das elektroneutral Anionen wie beispielsweise Chlorid gegen
OH- austauscht und dadurch spezifisch den OpH abbaut . Im Gegensatz zu Nigericin, welches
ebenfalls den OpH abbaut, brauchen die Zellen nicht mit EDTA behandelt werden (Ahmed &
Booth, 1983) . Es konnte gezeigt werden, dass eine Konzentration von 200 ~tM TCC den OpH
von E. coli fast vollständig abbaut (Ahmed & Booth, 1983) . YYC202ldhA-Zellsuspensionen
mit einer OD600 von 2,7 (0,5 M MOPS, 100 mM KCI, pH 7 mit -100 mM Glucose) wurde
nach 4 Stunden Inkubation bei 37°C und 140 U .p.m . 200 ~tM TCC zugesetzt . Der Kontrolle
wurde ein entsprechendes Volumen Ethanol (85 ~tl) zugesetzt, da TCC in Ethanol gelöst war .
Die spezifische Glucose-Verbrauchsrate betrug sowohl vor als auch nach TCC- bzw . Ethanol-
Zugabe -0,33 ~tmol Glucose min' (mg Protein) -1 . Die Pyruvat-Bildungsrate sank nach TCC-
Zugabe um 20 % (0,5 bzw . 0,4 gmol min' (mg Protein) -1 ), die Pyruvat-Ausbeute blieb jedoch
im Vergleich zur Kontrolle unverändert (1,45 Mol Pyruvat/Mol Glucose) . Ein
Wiederholungsexperiment ergab vergleichbare Resultate . Da man nicht ausschließen kann,
dass es unter den genannten Bedingungen, d .h . pH 7, gar keinen OpH gibt, kann aufgrund