Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

26 MATERIAL UNDMETHODEN
Reaktionsbedingungen :
Denaturierung der DNA 5 min 95°C lx
Denaturierung der DNA 30 sec 95°C
Primer-"Annealing" 60 sec TM - 5°C 34 x
Primer-Elongation 1 min/kb 68°C
6 .7 .2 Kolonie-PCR
Bei diesem Verfahren wurden Zellen der zu untersuchenden Bakterienstämme direkt von
der Platte mit einem sterilen Zahnstocher abgenommen, auf einer frischen Agarplatte
ausgestrichen und anschließend die restlichen am Zahnstocher haftenden Bakterien in einem
PCR-Ansatz resuspendiert . Durch eine initiale Inkubation von 10 min bei 95°C wurden die
Zellen lysiert und somit die zu analysierende DNA freigesetzt . Die Reaktion wurde in einem
25-~tl-Ansatz durchgeführt . Bei der Kolonie-PCR wurde die Red-Taq-Polymerase (Sigma,
Deisendorf) eingesetzt . Dadurch konnten die Proben nach der PCR ohne Zugabe von
Probenpuffer direkt auf ein Agarosegel aufgetragen und analysiert werden .
6 .8 Konstruktion von Deletionsmutanten mit Hilfe des pK03-Systems
Deletionsmutanten von E. coli wurden durch eine Kombination von "Crossover"-PCR mit
dem Vektor pK03 (Link et al., 1997), der in E. coli bei 42 - 44°C nicht repliziert, konstruiert .
Für die "Crossover"-PCR wurden zunächst zwei etwa 500 bp große PCR-Produkte hergestellt,
die den 5'-flankierenden Bereich inklusive der ersten 6-8 Codons (Primer No- . . . und Ni- . . .)
bzw . den 3'-flankierenden Bereich inklusive der letzten 11-16 Codons (Primer Co- . . . und
Ci- . . .) des zu deletierenden Gens umfassten . Die äußeren Primer (No- . . . und Co- . . .)
enthielten eine Restriktionsschnittstelle, die für die Klonierung in pK03 genutzt wurde . Die
inneren Primer enthielten eine 21 bp lange komplementäre Sequenz an ihrem 5'-Ende (Ni- . . .-
21mer und Ci- . . .-21mer) . Die beiden PCR-Fragmente wurden gereinigt (vgl . 6 .1 .3 bzw . 6 .2)
und als Matrize in einer zweiten PCR mit den äußeren Primem eingesetzt. Dabei konnten die
beiden Fragmente über die 21- bzw . 33-bp-Sequenzen miteinander hybridisieren und
verlängert werden, so dass ein Fusionsprodukt entstand . Das Fusionsprodukt wurde verdaut,
gereinigt und in den entsprechend verdauten pK03-Vektor kloniert. Nachdem das durch PCR
erhaltene Fragment durch Sequenzierung überprüft worden war, wurden fehlerfreie Plasmide
mittels Elektroporation in E. coli transferiert und der Transformationsansatz auf LB-Platten