Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

28 MATERIAL UND METHODEN
verteilt und ÜN bei 37°C inkubiert . Die gebildeten Plaques wurden gezählt und der
Phagentiter in Phagen/ml bestimmt.
6 .9 .3 Durchführung der Phagentransduktion
Der Empfänger-Stamm wurde in 5 ml LB mit 0,2 % (w/v) Glucose und 5 mM CaC12 bis zu
einer OD600 von -0,5 - 1 bei 37°C kultiviert und anschließend 10 min bei 1500 g sedimentiert .
Das Pellet wurde in 1 ml 0,1 M M9S04/5 mM CaC12 resuspendiert . Danach erfolgte die
Transduktion nach folgendem Schema :
Nr . Volumen Empfänger-Zellen [pul] Volumen Plvir-Lysat [pul]
1 100 0
2 100 1
3 100 10
4 100 100
5 0 100
Die Nr . 1 diente dabei der Kontrolle auf entstehende Revertanten und die Nr . 5 diente der
Kontrolle auf Kontaminationen im Phagenlysat . Diese Ansätze wurden 30 min bei 30°C
inkubiert. In dieser Zeit erfolgte die Infektion der Empfänger-Zellen mit den Phagen . Zum
Abstoppen der Infektion wurden 100 pul 1 M Natriumcitrat zu den Ansätzen hinzugefügt, die
Zellen abzentrifugiert, in 100 pul LB mit 10 mM Natriumcitrat aufgenommen und zur
"phänotypischen Expression" 30 min bei 37°C inkubiert . Anschließend wurden die Zellen auf
LB-Platten mit dem geeigneten Antibiotikum ausplattiert und die Platten ÜN bei 37°C
inkubiert.
6.10 Tn5-Transposonmutagenese
Die Transposonmutagenese wurde zur Herstellung fluoro- oder bromopyruvatresistenter
E. coli-Stämme eingesetzt . Elektrokompetente MG1655-Zellen wurden mit dem Plasmid
pKNG101-Tn5 transformiert . Dann wurden 500 ~tl SOC-Medium (siehe 5 .1) zugegeben und
der Ansatz 1 h bei 37°C inkubiert ("phänotypische Expression") . Anschließend wurden
Aliquots auf LB-Platten bzw . M9-Minimalmedium-Platten (Glucose als C-Quelle)
ausplattiert, die Kanamycin und verschiedene Konzentrationen an Fluoro- bzw .
Bromopyruvat enthielten und die Platten ÜN bei 37°C inkubiert . Die resistenten Klone