Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

104 DISKUSSION
V DISKUSSION
Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von rekombinanten
Escherichia coli-Stämmen, die Glucose möglichst effizient in Pyruvat umsetzen und diese
Verbindung dann ins Medium ausscheiden . Bisher wurden dazu Hefe- oder E. coli-Stämme
eingesetzt, die eine Auxotrophie für Vitamine (Thiamin, Liponsäure) besitzen, die bei der
Decarboxylierung von Pyruvat benötigt werden . Durch geeignete Limitierung der Vitamine
kann die Aktivität des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes und der Pyruvat-Decarboxylase
verringert werden, was zu einem Anstau und Export von Pyruvat aus der Zelle führt . Bei
diesen Ansätzen konnten bisher maximal bis zu 1,2 Mol Pyruvat pro Mol Glucose gebildet
werden (Li et al., 2001a) . Im Unterschied dazu wurde in dieser Arbeit der acetatauxotrophe E.
coli-Stamm YYC202 für die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat eingesetzt, bei dem die
Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA oder Acetat durch Deletion oder Inaktivierung
der Gene für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex, die Pyruvat-Oxidase und die Pyruvat-
Formiat-Lyase völlig blockiert ist . Die primäre Charakterisierung dieses Stammes bezüglich
Acetat-Verwertung und Acetat-Toleranz zeigte, dass er sich drastisch von dem E. coli-
Wildtyp-Stamm MG1655 unterschied .
1 Parallele Umsetzung von Glucose und Acetat durch E. coli YYC202
Die Verwertung von verschiedenen Kohlenstoff-Quellen unterliegt in E. coli Wildtyp-
Stämmen oft der Glucose-Repression, d .h . bei Anwesenheit mehrerer C-Quellen wird
zunächst Glucose abgebaut und erst nach deren vollständigem Verbrauch werden die
alternativen C-Quellen umgesetzt, was zu einem diauxischen Wachstum führt . Dieses
Phänomen wurde auch bei der Umsetzung von Glucose und Acetat durch E. coli MG1655
beobachtet (Abb . 7), wobei in der Phase der Glucose-Umsetzung sogar noch Acetat gebildet
wurde . Demgegenüber wurden Glucose und Acetat durch E. coli YYC202 parallel
verstoffwechselt (Abb . 7), was zeigt, dass die im Wildtyp funktionierenden
Regulationsmechanismen in YYC202 ausgeschaltet bzw . verändert sein müssen . Die
Mutationen, die zu einer parallelen Verstoffwechselung führen, wurden durch die Acetat-
Auxotrophie des Stammes bei Wachstum auf Glucose-Acetat-Minimalmedium erzwungen, da
nur dann ein Wachstum überhaupt möglich ist. Welche Mutationen dies sind, ist bisher jedoch
nicht bekannt .