Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

90 ERGEBNISSE
Peptidmassenfingerprints wurden mit Hilfe der Software MS-Fit (http ://prospector .ucsf.edu/
ucsfhtm14.0/msfit.htm) mit Proteindatenbanken verglichen und damit Proteinen zugeordnet .
Bei dem Pyruvat-Produzenten YYC202 fehlten erwartungsgemäß die beiden Untereinheiten
AceE und AceF der Pyruvat-Dehydrogenase, da die entsprechenden Gene ja deletiert wurden
(Tab . 19) . Einen deutlichen Unterschied gab es bei den Schlüsselenzymen des
Glyoxylatzyklus, Isocitrat-Lyase (AceA) und Malat-Synthase (AceB) . Beide Proteine konnten
nur in MG1655 detektiert werden, nicht aber in YYC202 . Auch in den oben beschriebenen
DNA-Chip-Experimenten wurde gezeigt, dass die Expression des aceBAK-Operons in
YYC202 gegenüber MG1655 stark reduziert war (Tab . 19) . Somit gibt es in diesem Fall eine
gute Übereinstimmung zwischen mRNA- und Protein-Daten : beide deuten darauf hin, dass
der Glyoxylatzyklus in YYC202 möglicherweise völlig fehlt oder zumindest stark reduziert
ist . Im Pyruvat-Produzenten war gegenüber dem Wildtyp die Acetohydroxysäure-
Isomeroreduktase (kodiert durch ilvC) in geringerer Konzentrationen vorhanden . Dieses
Enzym ist an der Biosynthese der verzweigtkettigen Aminosäuren Valin, Leucin und
Isoleucin sowie von Pantothenat beteiligt. Ursache dafür könnte eine erhöhte intrazelluläre
Pyruvat-Konzentration in YYC202 sein . Auch bei den DNA-Chip-Experimenten war der
ilvC-RNA-Level in YYC202 gegenüber MG1655 reduziert (Tab . 19) .
Tab . 19 (nächste Seite) : Unterschiede im Proteom von E. coli YYC202- und E. coli MG 1655-Zellen (Y
bzw . MG) welche in Minimalmedium mit 10 mM Glucose und 2 mM Acetat kultiviert und bei einer
OD600 von -0,4 geerntet wurden . Die Proteine wurden durch 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt,
Coomassie-gefärbt und visuell analysiert . Proteine mit deutlich unterschiedlichen Intensitäten in den
beiden Stämmen wurden aus dem Gel ausgestanzt, mit Trypsin verdaut und die resultierenden
Peptide durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert .
Anhand des Peptidmassenfingerprints
konnten die Proteine identifiziert werden . Proteine, die in zwei unabhängigen Experimenten
veränderte Intensitäten zeigten, sind fett hervorgehoben . Die Proteine aus den Spots 2 und 5 (s . Abb .
27) konnten nicht identifiziert werden . Zum Vergleich sind auch die RNA-Verhältnisse der Gene, die
für diese Proteine kodieren, angegeben, wie sie aus den DNA-Microarray-Experimenten in drei
unabhängigen Experimenten ermittelt wurden . Molekulare Masse (in kDa) und der pl wurden der
Colibri-Datenbank entnommen (http ://genolist.pasteur .fr/ Colibri/) . n .a . = nicht auswertbar, UE =
Untereinheit .