Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

22 MATERIAL UNDMETHODEN
und HindlII/EcoRI geschnittene ;,-Phagen-DNA (200 ng/pul) verwendet, die im Verhältnis 1 :1
gemischt wurden . Damit wurde ein Größenbereich von 0,5 bis 21 kb abgedeckt . Bei
Fragmenten zwischen 0,1 und 1 kb wurde der DNA-Molekulargewichtsmarker XIV (100-bp-
Leiter, Roche Diagnostics, Mannheim) verwendet . Die DNA-Proben wurden für die
Elektrophorese mit 5 x Ladepuffer (0 .2 % (w/v) Bromphenolblau, 100 mM EDTA, 34,8 %
(w/v) Glycerin) versetzt . Die Herstellung der Gele und die Durchführung der Elektrophorese
erfolgte nach Sambrook (1989) . Nach der Elektrophorese wurden die DNA-Moleküle im
Agarosegel mit dem interkalierenden, fluoreszierenden Farbstoff Ethidiumbromid (0,5 mg/1)
angefärbt (10 min), gewässert (20 min) und das Gel unter UV-Licht mit einem Image
Master°VDS-System (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) fotografiert .
6 .5 .2 RNA-Agarose-Gelelektrophorese
Die RNA-Qualität wurden mit Formaldehyd-Gelen in einer denaturierenden Agarose-
Gelelektrophorese in 1 x MOPS (40 mM MOPS, 10 mM Essigsäure, 2 mM EDTA in DEPC-
Wasser gelöst, pH 7) überprüft. 20,75 ml Agaroselösung (0,25 g Agarose, 5 ml 5x MOPS,
15,75 ml DEPC-H20) wurde aufgekocht und anschließend mit 4,25 ml Formaldehyd (37,5 %)
versetzt. Der pH-Wert von Formaldehyd wurde vor der Verwendung mit Ionenaustauscher
(AG 501-X8 (D) Resin 20-50mesh, BioRad) auf pH >6 eingestellt . Die RNA-Proben wurden
vor der Elektrophorese mit 5 x Ladepuffer (50 % Formamid, 9,3 % Formaldehyd, 20
5 x MOPS, 50 ~tg/ml Bromphenolblau, 0,7 % Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml)) versetzt,
10 min bei 95°C und danach 5 min auf Eis inkubiert . Die Herstellung der Gele und die
Durchführung der Elektrophorese erfolgte nach (Sambrook et al ., 1989) der Elektrophorese
wurden das Formaldehyd-Gel gewässert (20 min) und das Gel unter UV-Licht mit einem
Image Master°VDS-System (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) fotografiert .
6 .6 Klonierungsexperimente mit E. coli
6 .6 .1 Herstellung kompetenter Zellen nach der Calciumchlorid-Methode
Durch eine Calciumchlorid-Behandlung erhielten exponentiell wachsende E. coli-Zellen die
Kompetenz, freie DNA aus dem Medium aufzunehmen . Die Präparation der kompetenten
Zellen erfolgte nach Cohen et al. (1972) : 50 ml SOC-Medium wurde mit 1/5o Volumen einer
LB-Vorkultur inokuliert und bis zu einer OD600 von -0,3 bei 37°C und 160 U .p.m . inkubiert
und anschließend abzentrifugiert . Alle weiteren Schritte wurden auf Eis durchgeführt . Die