Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe - JUWEL ...

36 MATERIAL UNDMETHODEN
Konzentration wurde wie unter 6 .4 beschrieben bestimmt . Die Qualität (E26o/E2so i .d.R . 1,6 -
1,8) wurde außerdem mittels Formaldehyd-Gelen (s . 6 .5 .2) überprüft . Die Lagerung von
präparierter RNA erfolgte bei -20°C .
8 .2 Synthese fluoreszenzmarkierter eDNA-Sonden
Für den Vergleich genomweiter Genexpressionsmuster wurden fluoreszenzmarkierte
cDNA-Sonden ausgehend von gleichen Mengen der zu vergleichenden RNA-Proben (25 lug)
synthetisiert (Wendisch et al., 2001) . Als Fluoreszenzfarbstoffe wurden jeweils die dUTP-
Analoga Cy3-dUTP (XAbsorption max 550 nm, 2,Fluoreszenz max 570 nm, grün, Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg) oder Cy5-dUTP (XAbsorption max 649 nm, %Fluoreszenz max 670 nm, rot,
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) verwendet . Die RNA (25 lag Gesamt-RNA in H2O
gelöst) wurde mit 500 ng Zufalls-Hexanukleotid-Primern (in ddH20 gelöst, Amersham
Pharmacia) inkubiert (65°C, 10 min) und anschließend 2 min auf Eis abgekühlt . Die reverse
Transkription wurde in einem Puffer durchgeführt, der 0,1 mM Cy3-dUTP oder Cy5-dUTP,
50 mM Tris-HCI, pH 8,3, 75 mM KCI, 3 MM M9C1 2 , 10 mM DTT, 0,5 mM dATP, 0,5 mM
dGTP, 0,5 mM dCTP, 0,2 mM dTTP und 400 U Superscript-11 Reverse Transcriptase (Life
Technologies, Inc ., Rockville, MD) enthielt (Wendisch et al., 2001) . Der 30 ~tl Ansatz wurde
10 min bei Raumtemperatur und anschließend 110 min bei 42°C inkubiert . Nach der reversen
Transkription wurde die RNA durch Zusatz von 10 ~tl NaOH (0,1 N) 10 min bei 70°C
hydrolysiert . Die Lösung wurde mit 10 ~tl HCl (0,1 N) neutralisiert . Die Abtrennung nicht
eingebauter Nukleotide erfolgte durch Ultrazentrifugationseinheiten (Microcon YM-30,
Millipore, Schwalbach) . Der 50 ~t1 Ansatz wurde mit Wasser auf 500 ~t1 aufgefüllt und durch
Zentrifugation (7 min, 13000 g) auf etwa 20 ~tl eingeengt . Danach wurden die für eine
Hybridisierung vorgesehenen Cy3- und Cy5-markierte Sonde vereinigt und es erfolgten, wie
beschrieben, zwei weitere Ultrafiltrationszentrifugationen (8 min, 13000 g) . Die so erhaltene
etwa 14 ~t1 cDNA-Sonde wurde entweder ÜN eingefroren oder sofort in
Hybridisierungsexperimenten eingesetzt .
8 .3 DNA-Chip-Hybridisierung
Die in dieser Arbeit verwendete DNA-Chip-Technologie zur Untersuchung differentieller
Genexpressionsmuster und das verwendete Robotersystem zur Herstellung von DNA-Chips
beruht auf dem an der Stanford University entwickelten System (Shalon et al., 1996) und