RCGI V31 N63

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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN BIOTECNOLOGÍA BIOENERGÍA REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA. Vol. 31 NÚM. 63. PP. 136 – 138 OCT. 2016 ISSN 0185-6294 ANÁLISIS IN SILICO DE ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA BIOSÍNTESIS DE LÍPIDOS EN Chlorella vulgaris Fernández-Sánchez Ricardo 1 , Tamayo-Ordoñez, Yahaira 2 , Ayil-Gutierrez Benjamin 3 , Sánchez-Teyer Lorenzo Felipe 2 , Cordova-Quiroz Atl Víctor 1 , Tamayo-Ordoñez Francisco Alberto 1 , Tamayo-Ordoñez, María Concepción 2 * 1 Dependencia Académica de Ciencias Química y Petrolera, Facultad de Química, Universidad Autónoma del Carmen, Avenida Concordia 24, Aviación, CP. 24100 Cd. del Carmen, Camp. México. 2 Unidad de Biotecnología y Unidad de Bioquímica, Centro de Investigación Científica de Yucatán, Calle 43 No. 130, Colonia Chuburná de Hidalgo, CP. 97200, Mérida, Yucatán, México. 3 CONACYT- Centro de Biotecnología Genómica, Instituto Politécnico Nacional, Blvd. del Maestro, s/n, Esq. Elías Piña, Reynosa, 88710, México. Autor de contacto: martamaodz@hotmail.com Recibido: 30/agosto/2016 Aceptado: 29/septiembre/2016 Publicado: 19/octubre/2016 RESUMEN En la actualidad se han implementado dos estrategias para incrementar la producción de lípidos en algas éstas son la optimización de cultivos y la manipulación genética. En la optimización de las condiciones de cultivo de algas se han obtenido rendimientos alrededor de 25 a 50% en la productividad de los triacilglicéridos (TGA) mientras que mediante la manipulación genética se ha descrito un incremento de 35 a 40% en lípidos, los resultados reportados por ambas estrategias no demuestran una diferencia significativa. Las variaciones en la acumulación y el contenido de lípidos entre géneros o incluso en especies pertenecientes al mismo género de algas está relacionado con ciertas características del hábitat de la especie y la diversidad de genes involucrados en la biosíntesis de ácidos grasos. En este estudio mediante un análisis in silico de tres enzimas involucrados en la biosíntesis de lípidos (Acetyl-CoA Carboxilasa, Diacilglicerol Aciltransferasa y glicerol-3-fosfato Aciltransferasa) de 17 géneros de microalgas demostraron que algunos géneros de algas que presentaron características semejantes en estructura terciaria exhibieron valores de acumulación y productividad de lípidos similares. Interesantemente, Chlorella vulgaris exhibió estructuras únicas de estas enzimas, así como, valores de productividad y acumulación de lípidos altos en comparación a otras algas. En este trabajo se abordó el estudio de los cambios en la expresión de los transcritos de tres enzimas involucradas en la biosíntesis de lípidos. También se realizó la comparación de las características de secuencia aminoacídica primaria y estructuras terciarias in silico de ocho enzimas de diferentes géneros de algas (incluyendo a Chlorella vulgaris). Palabras clave: biocombustibles, enzimas, microalgas. ABSTRACT Currently it has been implemented two strategies for increasing the algaes lipid production; these are the culture optimization and the genetic manipulation. Referring to the culture optimization it has obtained yields between 25 and 50% in the triacylglicerides productivity meanwhile by the genetic manipulation it has described an increasing between 35 and 40 % in lipids, the results reported by both strategies do not show a significant difference. the variations in the accumulation and lipid content between genres or even species belonging to the same algae genre it is related with certain characteristics from the species habitat and the diversity of genes involved in the fatty acids biosynthesis. In this study by an in silico analysis of three enzymes involved in lipid biosynthesis (Acetyl-CoA Carboxylase, DiacylGlycerol Acyltransferase and glycerol-3 phosphate Acyltransferase) of 17 genres of microalgae show that some algae genres presented similar characteristics in tertiary structure exhibited similar values of lipid accumulation and productivity. Interesting, Chlorella vulgaris, exhibited unique structures of this enzymes and highest values of lipid accumulation and productivity in comparison with other algae. In this paper it studied the changes in the expression of transcripts of three enzymes involved in lipid biosynthesis. Also it made the comparison of the primary amino acid sequence characteristics and tertiary structures in silico of eight enzymes from different algae genres (including Chlorella vulgaris). Keywords: Biofuels, enzymes, microalgae INTRODUCCIÓN El potencial uso de las microalgas para la producción de biocombustible ha sido sustentado por varias investigaciones. La optimización de cultivos en algas sugieren que el cultivo en un medio carente de nitrógeno y fósforo es el que propicia una mayor concentración de lípidos (Garibay et al., 2009; Fernández et al., 2012; Lei et al., 2012); sin embargo, a pesar de que las microalgas pueden acumular altos porcentajes de lípidos (>72%), su rendimiento en la producción y calidad de lípidos es baja (Tamayo-Ordoñez et al., 2016). El alto porcentaje de acumulación de lípidos, el T E C N O L Ó G I C O N A C I O N A L D E M É X I C O . I. T. M É R I D A
ANÁLISIS IN SILICO DE ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA BIOSÍNTESIS DE LÍPIDOS EN CHLORELLA VULGARIS bajo costo de su cultivo y su fácil adaptación a diversos medios acuosos son algunas características que presentan las microalgas manipuladas (Vuttipongchaikij, 2012; Bharat et al., 2014), por el contrario, las cepas aisladas de la naturaleza presentan algunas de éstas características, las cuales no son suficientes para cubrir la demanda de la producción de biodiesel (Vuttipongchaikij, 2012). Por otro lado, la ingeniería genética ofrece una solución a los problemas anteriores (Vuttipongchaikij, 2012; Breuer et al., 2014; Tamayo-Ordoñez et al., 2016). La investigación ha sugerido que la acumulación y productividad de lípidos en microalgas están relacionadas con las características de la especie, siendo así que dependiendo de las condiciones de estrés a la que es sometida y a sus características genéticas y propias de las enzimas involucradas en la biosíntesis de lípidos, podría presentar diferentes perfiles de acumulación, productividad y calidad de lípidos (Griffiths y Harrison, 2009; Mata et al., 2010). Conocer la relación de los aspectos moleculares de los genes codificantes de enzimas relacionadas a la biosintesís de lípidos en Chlorella vulgaris es el objetivo principal de este trabajo, además de generar información que pueda ser empleadas en un futuro en la transformación genética de esta alga e indagar en las características bioquímicas de las enzimas involucradas con la acumulación y productividad de lípidos de Chlorella vulgaris. MATERIAL Y MÉTODOS El análisis in silico de las secuencias aminoacídicas se realizó para 7 enzimas. Las secuencias fueron obtenidas de la base de datos GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se analizaron 5 secuencias de aminoácidos de ATP-CL (ATP Citrato-liasa) y PDC (Complejo de Piruvato Deshidrogenasa), 2 de KAS (3- Cetoacil ACP Sintasa) y FAT (Acil-ACP Tioesterasa), 9 de DGAT (DiacilglicerolAciltransferasa), 13 de ACC (Acetil- CoACarboxilasa) y 7 de GPAT (Glicerol 3- Fosfato(Aciltransferasa). Para el caso de las enzimas DGAT, ACC y GPAT, se incluyeron accesiones de algas ya reportadas por Tamayo-Ordóñez et al., (2016). Las secuencias de aminoácidos fueron alineadas con el programa de alineamiento Explorer /CLUSTALW y con el software MEGA (versión 7.0.14). El modelado de estructura terciaria se realizó mediante el software SWISS-MODEL. El estudio filogenético se efectuó mediante el método Neighbor - joining con un bootstrap de 1000 repeticiones. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El análisis in silico de las enzimas incluyó 23 especies y 19 géneros de algas. Según los resultados obtenidos mediante la construcción del dendrograma y modelado de estructuras terciarias se compararon los géneros y especies de algas (se designaron valores arbitrarios a las algas que se agrupaban en algún lado en los dendrogramas y también de acuerdo a la estructura terciaria que presentaba cada enzima) (Tabla1). El análisis de las enzimas FAT y KAS se excluyeron de la tabla 1, debido a que sólo se obtuvieron dos secuencias de aminoácidos, por lo cual no se realizó un análisis de similitud. Para la enzima LPAAT solo se llevó a cabo la construcción del dendrograma. Tamayo-Ordoñez et al. (2016), mediante el análisis in silico de las enzimas GPAT, ACC y DGAT reportó tres tendencias; la primera corresponde a que ciertas algas pueden estar relacionadas en el dendrograma y en estructura terciaria, la segunda que las especies pueden agruparse en el dendrograma pero no en estructura terciaria y la tercera que pueden no tener relación en los dendrogramas y tampoco en estructura terciaria. En este trabajo, mediante el análisis de las enzimas PDC y ATP-CL observamos que ciertas algas comparten estructura terciaria pero no existe una relación en el dendrograma. Estas diferencias encontradas en cinco enzimas involucradas en la biosíntesis de lípidos podrían desencadenar diferencias en la acumulación de lípidos, así como en la productividad del alga estudiada. CONCLUSIONES El potencial de las microalgas para la producción de los lípidos y otros compuestos de interés comercial ha aumentado en los últimos años. El incremento en el rendimiento del contenido de lípidos (entre el 35 al 89% de su peso seco) se han logrado mediante el cultivo de microalgas en condiciones óptimas. Del mismo modo, la manipulación genética de microalgas ha permitido alcanzar de un 20 a 72% en el contenido de lípidos (de su peso seco). Los altos valores en el contenido de lipidos obtenidos por ambos enfoques son similares. En la actualidad, la investigación está en la expectativa de nuevos enfoques que contribuyan al mejoramiento de la producción de lípidos en microalgas. Una nueva perspectiva para la manipulación de microalgas por ingeniería genética podría basarse en la identificación de genes de microalgas y la profundidad en los análisis bioinformático. AGRADECIMIENTOS Al doctor Lorenzo Felipe Vázquez Flota y a su grupo de colaboración. Se agradece al CICY, unidad de Biotecnología y Bioquímica de plantas por las instalaciones prestadas. Tabla 1. Resultados del análisis in silico de 5 enzimas involucradas en la biosíntesis de lípidos en algas. Algas D E.T. Algas D E.T. PDC ACC Micromonas commoda a 1 2 Micromonas comoda* 1 1 Auxenochlorella protothecoides b Micromonas pusilla* 2 1 1 1 Bathycoccus prasinos ab 3 1 Bathycoccus prasinos a 1 2 Chlamydomonas Cyclotella cryptica* reinhardti a 1 3 Nannochloropsis gaditana a 3 4 1 1 Nannochloropsis oculata* 1 1 Aureococcus anophagefferens 2 2 REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 31 NÚM. 63 137
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