RCGI V31 N63

RELACIÓN ENTRE EL ESTRÉS POR ALUMINIO Y LA BIOSÍNTESIS DE CAFEÍNA EN SUSPENSIONES CELULARES DE COFFEA ARABICA L.
demostrado que el aluminio puede disminuir el crecimiento
celular (Muñoz-Sánchez et al., 2013), pero aún se desconoce
a nivel intracelular que cambios puede generar en las vías del
metabolismo secundario. En el presente proyecto de
investigación se reportan los experimentos realizados que
permitieron estudiar la biosíntesis de la cafeína en respuesta
al estrés por aluminio en suspensiones celulares de C.
arabica L. Este estudio permitió entender los cambios
bioquímicos que genera este factor abiótico en la producción
de cafeína, en la actividad de la enzima que cataliza la
producción de este metabolito y en los niveles de transcritos
del gen que codifica a esta enzima.
MATERIAL Y MÉTODOS
oscuridad no fue posible cuantificar a la cafeína; sin
embargo, en las células expuestas con radiación luminosa se
cuantificaron hasta 90 µg de cafeína/g de tejido, este
resultado fue consistente a los reportes que han indicado el
estrés por luz como un inductor de la biosíntesis de cafeína
en los cultivos celulares. Por otro lado, las células
adicionadas con la teobromina en el medio de cultivo y luego
mantenidas en oscuridad o luz mostraron un incremento en
los niveles de cafeína, este resultado indicó que las células
solo necesitan del precursor para que se produzca el producto
final.
Cuadro 1. Contenido de cafeína en hojas y células de C. arabica L
mantenidas bajo diferentes condiciones de cultivo.
Condiciones de cultivo. Las suspensiones celulares de C.
arabica L. cv Catuai de la línea L2 se obtuvieron por
disgregación de callos y se cultivaron en medio MS
(Murashige y Skoog, 1962), Se generó una nueva línea de
cultivo celular denominada como L2RM, esta se obtuvo al
transferir la línea celular L2 en condiciones de luz continua
(8.3 W/m 2 ) a 25°C y en agitación a 100 rpm.
Tratamientos con AlCl 3 . Las células de 14 días de ciclo de
cultivo de la línea L2 o L2RM fueron tratadas con 100 µM o
500 µM de AlCl 3 .
Cuantificación de los niveles de cafeína. Se generaron
extractos de células liofilizadas para determinar los niveles
endógenos de cafeína y para cuantificar los niveles exógenos
se analizó el medio de cultivo. Para cuantificar el contenido
de cafeína en las muestras, se utilizó un método de separación
por cromatografía de capa fina de alta resolución (HP-TLC).
Cuantificación de proteínas. Para la cuantificación de la
concentración de proteínas en las suspensiones celulares de
cada condición experimental, se utilizó el método comercial
del ácido bicinconínico (Smith, 1985).
Actividad de la cafeína sintasa in vitro. Para la determinación
de la actividad de la cafeína sintasa, se utilizó la S-adenosil-
L-( 3 H-metil) metionina (SAM) marcada radiactivamente
como donador del grupo metilo a la teobromina, la estrategia
experimental fue descrita por Mazzafera et al., (1994).
Niveles de transcritos de la cafeína sintasa. El ARN total se
extrajo de las células de C. arabica L. por el método de
Trizol, se sintetizó el ADN complementario y luego se
analizaron los niveles de expresión mediante PCR punto final
y tiempo real. Los productos de PCR fueron visualizados
mediante electroforesis.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el Cuadro 1 se puede observar el contenido de cafeína en
las muestras de los extractos generados de hojas y células. En
la muestra del testigo positivo de hoja, se observó el nivel
más alto de cafeína con un valor de 6 mg de cafeína/g de
tejido seco. En el extracto generado de células mantenidas en
Figura 1 Efecto de 500 µM AlCl 3 en los niveles endógenos (A) y exógenos
(B) de cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. mantenidas en
luz (8.3 W/m 2 ). Las células de 14 días Control de ciclo de cultivo fueron tratadas
sin ( ) Control y con 500 µM de AlCl 3 ( ) AlCl durante 3
100 M 0, 4, 6, 10 y 24 horas. Las
barras representan Al 100 M el resultado es de tres experimentos por duplicado ±
Teo 555 M
DE. Teo 555 M
Teo + Al
Teo + Al
40 REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 31 NÚM. 63