RCGI V31 N63

REGENERACIÓN DE PLANTAS A PARTIR DE RAÍCES TRANSFORMADAS DE PENTALINON ANDRIEUXII (MÜLL. ARG.) HANSEN & WUNDERLIN CON EL GEN DE LA PROTEÍNA
ROJA FLUORESCENTE.
características nuevas, para convertirla en un modelo de
estudio para la producción masiva de metabolitos
secundarios. El presente trabajo está basado en la
transformación genética de plantas y la tecnología de cultivo
de tejidos vegetales para la regeneración de plantas a partir
de raíces transformadas utilizando la cepa bacteriana
Agrobacterium rhizogenes que contiene el gen que codifica
para la proteína roja fluorescente, debido a que los genes
marcadores son una manera fácil para marcar las células
transformadas con el propósito de investigar la expresión
génica transitoria o para establecer la transformación.
MATERIAL Y MÉTODOS
La estrategia experimental consistió en la desinfestación de
las semillas para la germinación, luego, la obtención de
explantes para la transformación utilizando dos cepas de A.
rhizogenes para obtener líneas de raíces transformadas y
caracterizarlas estableciendo una curva de crecimiento y
dándoles mantenimiento periódicamente para la inducción de
brotes y posteriormente confirmar la transformación de
raíces y brotes por medio de microscopía con filtros de
fluorescencia roja y por análisis de PCR.
Figura 5. Líneas de raíces transformadas de explantes de hoja e hipocótilo
de Pentalinon andrieuxii en medio PC líquido adicionado con cefotaxima
250 µgmL -1 .
Para comprobar la transformación de las líneas de raíces
obtenidas, se utilizó un estereoscopio modelo MZFL3 con
filtros de fluorescencia roja, con cámara FLUO III, y cámara
del lente DFL320 al 1x. En la figura 2 se muestran los
resultados de la raíz testigo y las raíces transformadas que
fueron utilizadas para ser observadas en el estereoscopio.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se realizó la transformación con explantes (hoja, raíz e
hipocótilo) de P. andrieuxii con la cepa A. rhizogenes. En la
siguiente tabla se muestra la frecuencia de infección con cada
explante:
Tabla 1. Frecuencia de infección (FI) con A. rhizogenes ATCC15834 y
ATCC15834 RFP en explante de hipocótilo, hoja y raíz de P. andrieuxii.
FI (%): # de explantes positivos/ # explantes infectados x 100. (Yam-Puc, et
al; 2012b), P (%): Promedio de FI, - : No se realizó transformación.
Los promedios de frecuencia de infección de los tres
procesos realizados para la cepa ATCC15834 en el explante
de hoja fue del 11.3%, hipocótilo 6.3% y raíz 0%.
Se cuenta con tres líneas (A, A1 y B) de raíces transformadas
con la cepa ATCC15834 RFP, a partir de hoja e hipocótilo
establecidas previamente en el laboratorio (May-Mendoza,
2014). En la figura 1 se muestran las líneas de raíces (AH,
A1H, BHi), proveniente de diferentes explantes, con una
morfología distinta.
Figura 6. Raíces a partir de explantes de hoja, raíz e hipocótilo de
Pentalinon andrieuxii, transformadas con A. rhizogenes (ATCC15834 RFP)
que contiene el gen de la proteína roja fluorescente; imágenes tomadas en
estereoscopio modelo MZFL3 con cámara FLUO III, cámara del lente
DFL320 a 1x. Las letras muestran el testigo A: raíz testigo con luz normal,
B: raíz testigo con fluorescencia, C: raíz testigo con fluorescencia y luz
normal. 1: raíz transformada con luz normal, 2: raíz transformada con
fluorescencia y 3: raíz transformada iluminada con fluorescencia y luz
normal.
Durante el mantenimiento de las raíces transformadas con A.
rhizogenes ATCC15834 RFP estuvieron subcultivadas por
siete meses en medio líquido adicionado con antibiótico
cefotaxima 250µg/mL, en un orbitador a 100 rpm en cuarto
de cultivo de luz contínua. A los siete meses de
mantenimiento se observó la formación de brotes
adventicios, por lo observado visualmente puede ser
organogénesis directa, no se podría afirmar, debido que hasta
el momento no se han realizado estudios histológicos que
comprueben el origen en la formación de brotes ni en la
formación de raíces. Ver fig. 3.
66 REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 31 NÚM. 63