RCGI V31 N63

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ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO PRIMARIO A PARTIR DE LA PULPA DENTAL HUMANA COMO MODELO DE ESTUDIO PARA LA DIFERENCIACIÓN CELULAR La pulpa dental contiene células madre mesénquimales nombradas como células madre de la pulpa dental (CMPD). Comparada con otras fuentes de células madre, como aquellas provenientes de la médula ósea o el tejido adiposo, las CMPD despliegan un gran potencial de multidiferenciación celular. Bajo condiciones de inducción especifica (in vitro), estas son capaces de diferenciarse en adipocitos, células neurales, miocitos, cardiomiocitos, hepatocitos, condrocitos y osteocitos (d´Aquino et al., 2007; Gronthos et al., 2000). La gran plasticidad celular de las CMPD, representan una gran oportunidad para generar un modelo de estudio para el análisis de los mecanismos de regulación que conllevan a la diferenciación y la generación de tejido especifico, los cuales podría ser benéficas para la terapia celular y el desarrollo eventual de tratamientos regenerativos (Cho et al., 2016; Ikeda et al., 2008). Por lo que el objetivo en este proyecto, es establecer un sistema de cultivo in vitro de CMPD para el estudio de los mecanismos moleculares que conllevan al establecimiento de la reprogramación y destino celular específico. METODOLOGÍA Para realizar este estudio, se reclutaron pacientes sanos de ambos sexos, en un intervalo de 12 a 24 años de edad que acudieron a la Clínica de Odontología de la Universidad Autónoma de Yucatán. Su tratamiento contempló extracciones de primeros premolares superiores e inferiores y ellos fueron informados del estudio para su consentimiento. Inmediatamente después de las extracciones, los órganos dentales se lavaron con solución 1X PBS pH 7.4 y se colocaron en un tubo estéril de 15 ml que contenía medio de cultivo Medio de Cultivo Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) frío, suplementado con una solución antibiótica [penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 µg/ml). Bajo cámara de flujo laminar y empleando un micromotor equipado con un disco diamantado (# 20), se realizó un corte transversal a ±2 mm del ápice, con la finalidad de acceder a los conductos radiculares y extraer en una sola intención las pulpas dentales. Posteriormente, el tejido pulpar fue colocado en una caja de Petri estéril con medio DMEM suplementado con una solución antibiótica como se mencionó previamente y enriquecido con suero fetal bovino (SFB) al 10 %. Para llevar el cabo el aislamiento celular, se utilizaron dos métodos de aislamiento: por explante y digestión enzimática (Fig. 1). En el primer método, el tejido fue cortado en pequeñas porciones de aproximadamente 2 mm 2 con un bisturí de hoja N. º 12 y se homogeneizó empleando el émbolo de una jeringa. Para el aislamiento de las células por el método de digestión enzimática, las pulpas dentales se colocaron en una solución de 3 mg/ml de colagenasa tipo I y 4 mg/ml de dispasa durante 30 y 60 min. Pasado el tiempo de digestión enzimática, las células fueron lavadas con medio DMEM durante 3 minutos. Los extractos digeridos de las pulpas dentales se cultivaron en cajas de petri en presencia del medio de cultivo D-MEM suplementado con una solución antibiótica y enriquecido SFB al 20 % hasta la obtención de colonias clonogénicas, aproximadamente después de 2 a 5 semanas de cultivo. Los cultivos primarios de células de la pulpa dental se mantuvieron en condiciones de cultivo celular (37º C y 5% CO) cambiando el medio cada 3 días hasta que alcanzaron un estado de confluencia del 80%. El crecimiento celular fue valorado semanalmente así como la ausencia de contaminación bacteriana o fúngica por medio de microscopio de fase invertida. Figura 1. Esquema general de la estrategia experimental utilizada para la obtención de un cultivo primario a partir de la pulpa dental humana. A) Método por explante (ME), en el cuál el explante es seccionado con ayuda de un bisturí B) Método por digestión enzimática (MDE), en el cual el tejido es seccionado como en A, e incubado con una solución enzimática de colagenasa y dispasa como se describe en la Metodología. RESULTADOS Y DISCUSIÓN La expansión de las células madre en cultivo es un paso crucial para su utilización en la medicina regenerativa, es por ello la importancia de generar conocimiento acerca del comportamiento biológico de las células durante su cultivo in vitro. Diversos estudios han demostrado que el método de aislamiento tiene un efecto en la expansión de las células (Derakhshani et al., 2015). El objetivo de éste trabajo fue comparar dos métodos de aislamiento de células de la pulpa dental. Los resultados demostraron diferencias morfológicas en ambos métodos. En el método por explante no se observó colonias de células durante los 5 y 24 días de cultivo (Figura 2A). Las células aisladas mediante este método presentaron una lenta velocidad de proliferación y por lo tanto fue menos eficiente. Se observó que en el tejido existía cúmulos con coloración negra-parda lo que indicó la aparición de necrosis. Probablemente, por la falta de irrigación sanguínea, o por la ausencia de nutrientes delimitada por el contacto con el medio y las células dentro de la masa de pulpa dental, lo que pudo influir con la muerte celular (Potdar et al., 2015). En la Figura 2B, se puede observar que las células aisladas mediante digestión enzimática fueron capaces de formar colonias clonogénicas a partir de 5 días de cultivo con una confluencia del 80%. Este cultivo celular presentó células con morfologías alargadas, aplanadas y similares a los 76 REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 31 NÚM. 63
ACTIVIDAD ANTAGONISTA DE BACTERIAS AISLADAS DEL SUELO DEL GÉNERO STREPTOMYCES CONTRA HONGOS FITOPATÓGENOS fibroblastos. Esto coincide con trabajos reportados que señalan que la disgregación del tejido, permite aumentar el área de contacto y liberar a las células dentro del tejido permitiendo que las células tengan contacto con la superficie de la placa y lograr su expansión en monocapa (Gronthos et al., 2000). pivotal synergy leading to adult bone tissue formation. Cell Death Dif. Vol 14: 1162-1171. Gronthos, S., M. Mankani, J. Brahim, P. G. Robey & S. Shi (2000) Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Nat Acad Sci U S A, Vol 97 (25): 13625-13630. Ikeda, E., K. Yagi, M. Kojima, T. Yagyuu, A. Ohshima, S. Sobajima, M. Tadokoro, Y. Katsube, K. Isoda, M. Kondoh, M. Kawase, M. J. Go, H. Adachi, Y. Yokota, T. Kirita & H. Ohgushi (2008) Multipotent cells from the human third molar: feasibility of cell-based therapy for liver disease. Differentiation, 76: 495-505. Potdar, P.D., Jethmalani Y.D. (2015) Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World Journal of Stem Cells. 7(5):839-851. doi:10.4252/wjsc.v7.i5.839. Figura 2. Células de la pulpa dental obtenidas mediante los métodos por digestión enzimática y por explante. A) Células aisladas por digestión enzimática B) Células aisladas por el método de explante. Las microfotografías representan el cultivo primario durante 0, 5 y 24 días posteriores al inicio del cultivo celular, mantenidas a 37°C y 5% de CO 2 . CONCLUSIONES Las células provenientes de la pulpa dental de premolares y obtenidas mediante digestión enzimática, presentaron mayor estabilidad debido a que se logró la formación de colonias con características clonogénicas. Se espera que los resultados obtenidos en este proyecto, tengan un impacto directo en el sector salud, ya que las células madres generadas podrían representar una herramienta útil en investigación básica y para el desarrollo de futuras aplicaciones clínicas. AGRADECIMIENTOS La presente investigación es financiada por el CONACYT en el marco del programa Cátedras-CONACYT (Proyecto No. 1882). REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Bianco, P. (2014) "Mesenchymal" Stem Cells. Ann Rev Cell Dev Biol. Vol 30, (30): 677-704. Cho, H., S. Tarafder, M. Fogge, K. Kao & C. Lee (2016) Periodontal ligament stem/progenitor cells with protein-releasing scaffolds for cementum formation and integration on dentin surface. Connect Tiss Res. DOI: 10.1080/03008207.2016.1191478 d'Aquino, R., A. Graziano, M. Sampaolesi, G. Laino, G. Pirozzi, A. De Rosa & G. Papaccio (2007) Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 31 NÚM. 63 77
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