RCGI V31 N63

DETECCIÓN DE ÁCIDO BETULÍNICO Y URECHITOLES EN LAS RAÍCES TRANSFORMADAS CON EL GEN DE LA PROTEÍNA ROJA FLUORESCENTE DE PENTALINON
ANDRIEUXII
Debido a que Pentalinon andrieuxii produce bajas cantidades
de estos metabolitos y que la especie es susceptible a la
transformación vía Agrobacterium (Yam Puc, 2012), se ha
logrado la obtención de raíces peludas, a partir de explantes
de hojas, hipocótilos y raíces, que podrían ser útiles para
aumentar su producción in vitro y elucidar los tejidos que
biosintetizan al AB y U.
(Hexano/ Diclorometano/Acetona) (6/2/2 V/V), se puede
observar en la Figura 1, la presencia de AB en las líneas de
raíces, al igual que en los respectivos medios líquidos,
aunque se puede visualizar con mayor facilidad en las raíces,
esto tal vez se debe a que hay mayor cantidad de AB en las
raíces que en los medios. Es notable la ausencia de urechitol
en todas las muestras.
En este trabajo se pretende identificar la línea de raíces
transformada que genere la presencia de uno o ambos
metabolitos secundarios, dando paso así en futuras
evaluaciones, obtener suficiente biomasa para su extracción
y purificación. En el caso de los urechitoles permitiría
obtener suficientes cantidades para probar su actividad
biológica contra microorganismos y parásitos evitando de
esta forma el exterminio de las poblaciones silvestres.
MATERIAL Y METODOS
El material vegetal con el que se trabajó fueron tres líneas de
raíces a partir de los explantes de hojas, hipocótilos y raíces
transformadas con la cepa ATCC15834 RFP de
Agrobacterium rhizogenes utilizando como marcador el gen
de la proteína fluorescente roja las cuales fueron inducidas y
caracterizadas por May Mendoza, (2016).
Las raíces transformadas de cada línea de un mes de edad
fueron lavadas con agua destilada y secadas en una
liofilizadora por tres días a -45°C. Las muestras secas se
maceraron con N 2 líquido para después dejarlas en reposo
con metanol. Se trataron las muestras con diclorometano para
posteriormente realizar la cromatografía en capa delgada.
En cuanto a la extracción del medio líquido de las líneas
celulares, se realizó una bipartición líquido-líquido
realizando los mismos pasos mencionados para la obtención
de los extractos para su posterior uso en cromatografía en
capa delgada.
Para la detección del compuesto ácido betulínico (AB)
mediante cromatografía, se corrió la muestra bajo el sistema
de elución de Hx/CH2Cl2/An (Hexano/
Diclorometano/Acetona) (6/2/2 V/V) como eluyentes
utilizando un cristalizador, una vez terminado este, se reveló
usando el agente revelador ácido fosfomolíbdico, seguida de
un calentamiento a 100°C con una pistola de aire para la
visualización del ácido betulínico de acuerdo a un estándar
de sigma.
Para la detección de urechitol se usó el sistema de elución
(fase móvil) de AcOEt/Hx/MeOH (Acetato de etilo/ Hexano/
Metanol) a (7.6/2/0.4) bajo los mismos pasos mencionados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La CCD (Cromatografía en Capa Delgada) permitió
determinar la presencia de ácido betulínico y urechitol. Se
empleó el sistema de elución para AB: Hx/CH 2 Cl 2 /An
Figura 2. Perfil cromatográfico por CCD de las fracciones de polaridad
media para AB en las líneas de raíces. (Hoja, hipocótilo y raíz con sus
respectivos extractos de medio líquido) utilizando el sistema de elución
HX:CH 2 Cl 2 :An (6/2/2).
En la Figura 2, se visualiza que no hay presencia de urechitol
a pesar que se corrió la placa con las mismas muestras
utilizando el sistema indicado para urechitol,
AcOEt:Hx:MeOH (6/2/2), solamente se visualizó
nuevamente la presencia de AB en las muestras.
Figura 3. Perfil cromatográfico por CCD de las fracciones de polaridad
media para UR en las líneas de raíces. (Hoja, hipocótilo y raíz con sus
respectivos extractos de medio líquido) utilizando el sistema de elución
AcOEt:Hx:MeOH (6/2/2).
Para confirmar la presencia de AB se realizó una
cocromatrografia utilizando el estándar de ácido betulínico y
la muestra elegida al azar (LBHi) con el sistema empleado
para el caso de este metabolito; HX:CH2Cl2:An (6:2:2).
Como se puede visualizar en la Figura 3, efectivamente se
trata de AB ya que no hubo diferencia en cuanto a la corrida
en la placa, están a la misma distancia.
Se identificó AB en las raíces transformadas obtenidas a
partir de los tres explantes, pero la ausencia de urechitoles en
las tres líneas de raíces transformadas.
En los trabajos realizados por Ramírez Albores (2016) con
plantas transformadas regeneradas a partir de hipocótilo, y
Jiménez Aguilar (2016) con plantas a partir de hoja, ambas
REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 31 NÚM. 63 59