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EFECTO DE 6-BENCILAMINOPURINA Y KINETINA EN LA REGENERACIÓN IN VITRO DE STEVIA REBAUDIANA MORITA II
Moisés Santiago Bertoni botánico suizo, detalló el sabor
dulce de Estevia, en 1900 el químico paraguayo Ovidio
Rebaudi, logró aislar dos principios activos: uno dulce y otro
amargo que fueron llamados esteviósido y rebaudiosido,
(Guerrero, R., 2005). La variedad Morita II de estevia, fue
desarrollada en Japón por Toyosigue Morita, la cual presenta
mayores rendimientos de hoja seca y mejor contenido en el
compuesto edulcorante que otras variedades de la especie.
Estevia puede reproducirse por aquenios que por su
polinización cruzada produce plantas con características
heterogéneas y gran parte de los aquenios son estériles
(Melillo, P., 2000). La multiplicación de plantas por esquejes
es otra alternativa para su propagación considerando el uso
de gran parte del material vegetal de campo.
La aplicación de métodos biotecnológicos por medio del
cultivo de tejidos, permite la obtención de plantas
homogéneas a partir de células, tejidos u órganos, siendo una
alternativa prometedora para multiplicar plantas de estevia en
corto tiempo comparado con el requerido para la
multiplicación convencional.
Esta alternativa ha sido aplicada por diferentes
investigadores, utilizando S. rebaudiana Bertoni, sin
embargo, los protocolos que se han establecido requieren su
adecuación para otras variedades, como es el caso de Morita
II, la cual presenta mayores cantidades de los componentes
químicos de interés económico y médico. Por lo tanto, el
objetivo de esta investigación fue establecer un método que
permita la obtención de plantas in vitro por medio de la
multiplicación clonal de Stevia rebaudiana Morita II.
MATERIALES Y MÉTODOS
El material vegetal consistió en plantas de estevia cultivadas
en maceta de aproximadamente 4 meses de edad en
condiciones de sombreadero. Se colectaron de estas plantas
las ramas jóvenes con crecimiento activo, de 10 a 15 cm de
longitud, con hojas sanas y extendidas. Las ramas se lavaron
superficialmente con una solución jabonosa conteniendo
Hipoclorito de Sodio al 1% (v/v) utilizando cloro comercial
de la marca Cloralex y se enjuagaron con agua corriente.
Posteriormente se separaron las hojas de los tallos dejando
aproximadamente 1/4 de hoja conectada al tallo y estos se
asperjaron con etanol al 70% % (v/v), se enjuagaron con agua
estéril, para la descontaminación se trabajó en campana de
flujo laminar, sumergiendo los tallos en una solución al 25%
(v/v) de Hipoclorito de Sodio adicionado adicionados con 1
ml de Tween 80 por litro de solución, durante 15 minutos de
exposición con agitación continua, los tallos
descontaminados se enjuagaron tres veces por 5 minutos cada
vez en agua estéril en campana de flujo laminar, utilizando
estos como fuente de explante.
Para lo obtención de los explantes, se utilizaron los tallos
previamente descontaminados y mantenidos en agua estéril.
Los explantes consistieron en segmentos nodales,
conteniendo un nudo manteniendo al explante el pecíolo de
la hoja y quedando eliminada la lámina de la hoja. Los cortes
para la obtención del segmento nodal se realizaron a 0.5 cm
por arriba y por debajo del nudo, procediéndose a su
inoculación en el medio de cultivo correspondiente.
Como medio de cultivo base se utilizaron las sales de
Murashige y Skoog 1962, (MS) adicionado con 100 mg/l de
Mioinositol, 4 mg/l Acido de Nicotínico, 4 mg/l de
Piridoxina, 4 mg/l de Glicina, 30 g/l de Sacarosa y como
gelificante 7 g/l de Agar. El pH se ajustó a 5.8 antes de
esterilizar. Los diversos medios fueron distribuidos en
frascos tipo Gerber y la esterilización se realizó en autoclave
a 121 o C y 15 libras/pulgada 2 por 15 minutos.
Los diferentes medios de cultivo probados fueron formulados
con el medio base y con la presencia o ausencia de las
citocininas 6-Bencilaminopurina (BAP) y Kinetina (KIN),
como se muestra en la tabla 1, con 15 repeticiones por
tratamiento.
Tabla 1. Medios de cultivo evaluados para la obtención de brotes de S.
rebaudiana Morita II
Tratamiento BAP (mg/l) Kinetina (mg/l)
T 0 0.0 0.00
T 1 0.10 0.10
T 2 0.10 0.40
T 3 0.40 0.10
T 4 0.50 0.25
T 5 0.25 0.50
T 6 0.70 0.40
T 7 1.00 1.00
Los cultivos de segmentos nodales fueron incubados a
temperatura de 25 +/- 2 o C y fotoperíodo de 16 horas luz con
la ayuda de lámparas fluorescentes (100 luxes).
Para el enraizamiento, los brotes desarrollados a partir de los
explantes inoculados fueron cultivados en el medio de
cultivo base e incubados en las condiciones antes descritas
para los segmentos nodales.
Los parámetros se evaluaron fueron: Número de brotes por
explante, Longitud del brote y Número de hojas por brote. El
análisis estadístico se realizó utilizando el programa SPSS20.
El tiempo transcurrido para la evaluación fue de 15 días.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Durante la aplicación del diseño experimental para
determinar el efecto que tienen los reguladores de
crecimiento BAP y KIN sobre el cultivo in vitro de S.
rebaudiana Morita II, se cuantificaron las variables
morfométricas, número de brotes (NB), longitud del brote
(LB) y el número de hojas por brote (HB), encontrando que
el efecto de los medios adicionados con reguladores de
crecimiento presentaron una mejor respuesta de NB y HB
con respecto a la ausencia de los reguladores de crecimiento
(Tabla 2).
REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 31 NÚM. 64 9