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7.3.4 Métodos moleculares para diagnóstico de resistencia
Los mecanismos moleculares responsables de la resistencia antihelmíntica
hacia los diferentes compuestos antihelmínticos han sido poco estudiados y
únicamente se ha descrito la técnica en detalle para diagnóstico de resistencia
a Benzimidazoles, como el mecanismo para levamisole/ Pyrantel y la
resistencia a Lactonas macrocíclicas permanece sin dilucidar. La utilización de
herramientas moleculares como PCR en tiempo real y el análisis de
Pyrosecuenciación para el diagnóstico de pequeñas mutaciones causantes
de la resistencia antihelmíntica, hasta ahora no han sido desarrolladas
satisfactoriamente. La manera en que hasta ahora se puede realizar una
prueba molecular de resistencia antihelmíntica en nematodos hacia los
compuestos mencionados, se basa en la utilización de ADN proveniente una
mezcla de larvas con lo que se podría obtener una prueba de resistencia de
manera rutinaria, de otra manera evaluar la resistencia en un numero
representativo de estadios únicos es demasiado costoso y no se justifica tal
gasto.
7.3.4.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La sensibilidad de la técnica molecular de RT-PCR (Transcripción Reversa -
en Cadena de la Polimerasa) se recomienda para detectar RA a los
bencimidazoles en H. contortus. Se recomienda utilizar larvas infectantes L3
sin vaina, las cuales serán conservadas a – 70C hasta su uso. El DNA deberá
ser extraído con base en el protocolo (anexo 1).Las muestras serán
amplificadas iniciando con 4 min a 94C. seguida por un ciclo de 40 a 94C por
30 sec, el alineamiento se realizará a 57C
por 30 sec y la extensión se realizará
a 72C por un min. El paso final se realizará a 72C
por 5 min. La presencia de
DNA será confirmada por geles de agarosa al 1%
con bromuro de etidio. La
aplicación de esta técnica a nivel comercial estará sujeta a un estudio previo
sobre aspectos económicos de la técnica con respecto a los beneficios
esperados, considerando los altos costos del equipo especializado para llevar
a cabo las pruebas moleculares correspondientes (LópezArellano, 2004)
Anexo 1
Preparación de DNA genómico de H. contortus usando una
microcentrífuga
Preparación de la muestra
1. Pesar hasta 20 mg de la muestra de tejido y colocarla en un tubo de
microcentrifuga de 1.5 ml
2. Adicionar 274 l de Solución de Digestión de la Mezcla Master a cada
tubo
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