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minutos. Nota: si se trabaja con muestras congeladas el tratamiento
con RNasas se puede omitir.
8. Colocar la muestra un minuto en hielo para enfriarla rápidamente.
9. Adicionar 100 μl de la solución de precipitación de proteínas del kit.
10. Vortexear vigorosamente a máxima velocidad por 20 segundos para
mezclar la solución de precipitación de proteínas uniformemente
con el lisado celular.
11. Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 1 minuto. Las proteínas
precipitadas deben formar una pastilla compacta de color café oscuro.
Si la pastilla de proteínas no es compacta, repita el paso 10, seguido
de una incubación en hielo por 5 minutos y después repita el paso 11.
12. Verter el sobrenadante conteniendo el ADN (dejando la pastilla de
proteínas precipitadas en el tubo usado) a un tubo nuevo de 1.5 ml
conteniendo 300 μl de isopropanol al 100% (2-propanol).
13. Mezclar invirtiendo suavemente 50 veces.
14. Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 1 minuto; el ADN será visible en
forma de una pastilla pequeña de color blanco.
15. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo brevemente en una toalla de
papel absorbente. Adicionar 300 μl de etanol al 70% e invertir el tubo
varias veces para lavar la pastilla deADN.
16. Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 1 minuto. Cuidadosamente
elimine el etanol invirtiendo el tubo. Tenga cuidado de no perder la
pastilla deADN.
17. Invertir y secar el tubo en una toalla de papel absorbente nueva y deje
secar al aire 5 segundos (o hasta que no se observe etanol residual).
18. Adicionar 100 μl de solución de hidratación de ADN y mezcle en el
vortex por 5 segundos a media velocidad para mezclar bien. O bien
resuspender el 100 μl de agua libre de nucleasas.
19. Incubar la muestra a 65°C por 5 minutos para acelerar la hidratación.
20. Guardar a -20 o a -70 °C.
Materiales:
1. Tubos de centrífuga de 15 y 50 ml.
2. Tubos de micro-centrífuga de 1.5 ml.
3. Búfer de Extracción de ADN; EDTA 100 mM, Tris 10 mM, SDS 0.5 %,
ajustar el pH a 8.0.
4. Fenol-Cloroformo-Alcohol isoamílico 25:24.1.
5. Etanol 100%.
6. Etanol 70% en agua.
7. Mortero y pistilo estériles y mantenidos a -20 ó -70 °C.
8. Medio RPMI.
9. Medio RPMI con glicerol al 7%.
10. Agua libre de nucleasas.
11. Proteinasa K.
12. Micropipetas de 10, 200 y 1000 μl.
13. Puntas para micropipeta de preferencia con filtro de 10, 200 y 1000 μl.
14. Guantes de látex desechables.
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