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11. Extracción de ADN de hemoparásitos
Juan Joel Mosqueda Gualito
11.1. Introducción
Actualmente, el diagnóstico de muchas enfermedades parasitarias está
basado en el análisis de ácidos nucleicos, específicamente el ADN. Las
técnicas moleculares como el PCR, permiten analizar cantidades muy
pequeñas de ADN, de tal manera que se permite la identificación de agentes
parasitarios en cantidades no detectadas por métodos convencionales (Weiss
1995; Prichard 1997; Singh 1997; Zarlenga and Higgins 2001) . Para poder
analizar el ADN de los parásitos de interés es necesario, en la gran mayoría de
los casos, extraerlo de los tejidos y las células y agregarlo en forma pura y en
cantidades conocidas. Por lo tanto, una característica importante del ADN
analizado mediante este tipo de pruebas es su calidad y pureza; es por esto
que el método de extracción de ADN es fundamental para asegurar el éxito de
la prueba (Watson, Gilman et al. 1998; Bartlett 2003). Un ADN de mala calidad,
es decir que esté parcialmente degradado, no podrá ser analizado; por otra
parte, si éste viene contaminado con otros agentes químicos utilizados
durante la extracción o con proteínas, no podrá ser cuantificado correctamente
o bien estas sustancias inhibirán la reacción de PCR o terminarán degradando
el ADN de la muestra. El ADN genómico es fácil de obtener en forma
fragmentada, pero la dificultad de obtener ADN se incrementa conforme
aumenta su tamaño y las moléculas de más de 150 kilobases (Kb) se
fragmentan fácilmente por fuerzas generadas durante procesos usados
comúnmente para su purificación (Sambrook and Russell 2001) .
11.2. Fundamento de la manipulación del ADN
La extracción de ADN está basada en tres pasos fundamentales que son la
homogenización, la separación y la purificación. Cada una de ellas es
importante para asegurar la calidad de ADN de la muestra (Sambrook, Fritsch
et al. 1989).
La homogeinización es el primer paso en el proceso de extracción de ADN y
consiste en disgregar la estructura tisular y celular con el objetivo principal de
facilitar la liberación de los ácidos nucleicos. La homogeinización se puede
realizar mediante métodos físicos como el macerado, la sonicación, la
ebullición, la congelación-descongelación o el choque osmótico; métodos
químicos como el uso de detergentes (principalmente SDS); o biológicos como
el uso de proteinasas como la proteinasa K, la lisozima, etc. La idea es romper
el tejido de forma mecánica y posteriormente liberar los ácidos nucleicos de las
células lisando las membranas con detergentes y enzimas; éstas últimas
además destruyen los complejos núcleo-proteicos, incrementando la pureza
del ADN. El método de homogeinización a utilizar depende principalmente del
tipo de tejido del cual se quiera extraerADN; si es de parásitos completos como
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