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quedan unos pocos residuos que hay que purificar y de esta manera mantener
el ADN en forma prácticamente libre de otros compuestos. El último paso
consiste en la purificación deADN de la muestra con el objeto de eliminar todas
esas proteínas y contaminantes y dejar el ácido nucleico en solución listo para
usarse. La purificación se basa en la precipitación del ADN y lavados
usualmente con etanol a diferentes concentraciones para remover los
remanentes de proteínas y sobre todo el fenol y las sales que pueden inhibir las
reacciones de PCR. Si el método de separación se hizo a base de fenolcloroformo,
será necesario precipitar el ADN mediante etanol absoluto o
isopropanol y después someterlo a lavados con etanol diluido para remover
sales; si el método de separación fue a base de resinas, se procederá a
realizar los lavados directamente. Al final de este proceso se deberá eliminar
todo el fenol de la muestra ya que éste afectará la cuantificación por
espectrofotometría. Esto se puede hacer desecando el ADN ya sea mediante
centrifugación o desecado al vació o por ventilación. Una vez que se ha
eliminado todo el etanol contaminante el ADN se puede resuspender en agua
libre de nucleasas o bien en algún búfer a base de Tris y EDTA. Debido a que el
ADN ha formado una pastilla muy compacta en el fondo del tubo donde se
desecó usualmente la resuspensión se obtiene dejando el ADN con el líquido
en suspensión por varias horas a 37C y posteriormente se pasa por una putilla
de micropipeta suavemente para lograr una resuspensión homogénea
(Sambrook y Russell 2001).
Una vez que el ADN se ha resuspendido y cuantificado (ver Nota), se debe
preferentemente, alicuotar y almacenar a -20 o a -70°C hasta su uso, ya que la
congelación-descongelación continua de la muestra afectará eventualmente
su calidad. Bien almacenado puede durar incluso varios años. Este ADN ya
puede entonces utilizarse para las distintas aplicaciones, después de ser
cuantificado.
Nota: Al realizar extracciones de ADN, frecuentemente quedan proteínas
contaminantes en la muestra; las proteínas están fuertemente unidas al ADN y
es prácticamente imposible la remoción total de éstas. Para determinar la
concentración y pureza del ADN en solución, se mide la absorbancia de luz
ultravioleta (UV) en un espectrofotómetro.
Tanto el ADN como las proteínas absorben luz UV, pero cada uno tiene curvas
de absorbancia distintas. La máxima absorbancia de luz para el ADN es a una
longitud de onda de 260 nm y para las proteínas a una longitud de onda de 280
nm. Una densidad óptica (OD) de 1 corresponde a 50 μg/ml aproximadamente
para el ADN de doble cadena (E5) (Wassenaar 2002). El radio de las lecturas a
260 y 280 nm (OD 260/OD 280)
proporciona un estimado de la pureza del ácido
nucleico. Preparaciones puras de ADN tienen valores OD /OD de 1.8. Si
260 280
260 280
hay contaminación con proteínas o fenol, el valor de OD /OD será
significativamente menor a 1.8 y no se podrán hacer cuantificaciones
confiables de la cantidad de ADN (Sambrook et al. 1989). Aunque este método
no es muy confiable, es el más utilizado. Tiene las desventajas de no poder
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