Abrir - Bienvenidos a la Biblioteca del INIFAP - Instituto ...

15. Repetir los pasos 8-11 hasta que se obtenga una fase acuosa clara.
Estos lavados son muy importantes cuando se extrae ADN de sangre
ya que los eritrocitos contienen mucha hemoglobina que es difícil de
eliminar.
16. Precipitar el ADN de la fase acuosa obtenida mezclándola con 2
volúmenes de etanol absoluto frío e incubar en CO2 sólido por cinco
minutos. También se puede incubar a -20 °C toda la noche o se puede
incubar la muestra a -70 °C por un par de horas.
17. Centrifugar las muestras a máxima velocidad por 30 minutos a 4º C. El
ADN precipitado, usualmente invisible antes de la centrifugación,
forma una pastilla al fondo y a los lados del tubo.
18. Decantar el sobrenadante muy cuidadosamente para no perder la
pastilla.
19. Lavar elADN una vez con 500 μl de etanol al 70%.
20. Mezclar las muestras con un vortex y centrifugar máxima velocidad
por 10 minutos a 4°C.
Para disolver el ADN:
21. Secar la pastilla brevemente por 15 a 20 minutos en una campana de
flujo laminar o bien en un una centrífuga al vacío. Secar demasiado el
ADN dificultará la re-suspensión posterior de este (Bartlett y White
2003).
22. Disolver el ADN en agua libre de DNasas pasándolo varias veces por
una punta de micro-pipeta, e incubándolo por 10 min a 55°C.
23. Determinar la cantidad deADN por espectrofotometría.
Protocolo 4.
Pasos para la extracción de ADN de sangre infectada con Babesia spp.,
mediante el kit comercial Wizard® SV Genomic DNA Purification System
de Promega.
1. La sangre infectada de debe obtener siempre con anticoagulante en
bolsa o tubos, o bien defibrinada con perlas de vidrio. Vaciar la sangre
a tubos de centrífuga de 15 o 50 ml y centrifugarla a 1340 g por 15-25
minutos, desechar el plasma y las células blancas y resuspender el
paquete de eritrocitos conteniendo los parásitos en PBS 1X y se
congela a -20 °C o -70 °C.
2. Al siguiente día descongelar la muestra y centrifugarla a 3500 rpm por
25 minutos a 4°C. Se retira el sobrenadante y la pastilla se vuelve a
suspender en PBS. El proceso se repite hasta que la pastilla sea de
color gris, la cual contendrá pocas membranas de eritrocitos y
mayormente parásitos de Babesia.
3. Tomar 200 μl de esta pastilla y mercarlos con 150 μl del búfer de lisis
del kit y se mezcla por pipeteo.
4. Transferir la muestra lisada a una columna del kit la cual se coloca en
un tubo colector (Wizard® SV MinicolumnAssembly).
5. Centrifugar la muestra a 13,000 g por 3 minutos.
6. Remover la columna del tubo colector y desechar el líquido del tubo
186