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colector. Se vuelve a ensamblar la columna al tubo colector.
7. Adicionar 650 μl a la columna de la solución de lavado del kit (que ya
debe contener etanol) y centrifugar la muestra a 13,000 g por 1
minuto. Remover la columna del tubo colector y desechar el líquido
del tubo colector. Volver a ensamblar la columna al tubo colector y
repetir este paso para un total de cuatro veces.
8. Desechar el líquido del tubo colector, re-ensamblar la columna y
centrifugar por 2 minutos la muestra a 13,000 g, esto con objeto de
secar la matriz de unión de la columna.
9. Transferir la mini-columna a un nuevo tubo de 1.5 ml. Adicionar 30 μl
de agua libre de nucleasas que debe estar a temperatura ambiente.
Incubar por 2 minutos a temperatura ambiente.
10. Centrifugar la columna ensamblada en el nuevo tubo colector a
13,000 g por 1 minuto.
11. Sin desechar el ADN eluido, agregar otros 10 μl de agua libre de
nucleasas a la columna y centrifugar la columna ensamblada en el
nuevo tubo colector a 13,000 g por 1 minuto. El volumen total eluido es
de 40 μl.
12. Remover la columna y desecharla, y el ADN eluido se utiliza para
determinar la cantidad deADN por espectrofotometría.
13. Guardar a -20 ó -70 °C.
Protocolo 5.
Pasos para la extracción de ADN de sangre infectada con Babesia spp.,
mediante el kit comercial Puregene DNA Purification System (QIAGEN).
1.
El paso uno es idéntico al paso 2 del protocolo 4.
2.
El paso dos es idéntico al paso dos del protozoo 4.
3. Tomar 300 μl de la pastilla formada en el paso 2 y mezclarlos con 900
μl de la solución de lisis de células rojas sanguíneas (RBC) del kit.
Incubar por un minuto a temperatura ambiente; invertir el tubo
suavemente diez veces durante la incubación.
4. Centrifugar por 20 segundos a 13,000-16,000 x g. Remover la mayor
cantidad de sobrenadante posible con una pipeta dejando
5.
aproximadamente unos 10-20 μl de líquido residual encima de la
pastilla.
Vortexear vigorosamente por 10 segundos para resuspender la
pastilla en el líquido residual; esto facilita mucho la lisis celular en el
paso siguiente. No debe permanecer la pastilla de células después de
este paso.
6. Adicionar 300 μl de la solución de lisis celular del kit a las células
resuspendidas y pipetear varias veces para lisar las células. Las
muestras son estables en esta solución de lisis celular por hasta dos
años a temperatura ambiente.
7. Se puede dar un tratamiento con RNasa que es opcional.Aquí hay que
adicionar 1.5 μl de solución de RNasa A al lisado celular. Mezclar la
muestra invirtiendo el tubo 25 veces y se incuba a 37°C por 15
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