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14.Rodríguez SD, Buening GM, Green TJ. Andrew C. Cloning of Babesia bovis by in vitro Cultivatiion. Inf. and immun.1983; 42:15-18. 15. TodorovicRA, Kuttler KL. A babesiosis card agglutinatiion test. Am J Vet Res 1974;35;1347-1350. 16. Vega, C.A., Buening, G. M. Green, T.J. and Carson, C.A. In vitro Cultivation of Babesia bigemina. Am. J. Vet. Res. 1985ª; 46;416-419. 17. Vega, C.A., Buening, G.M., Rodriguez, S.D., Carson, C.A. y McLaughlin, K.: "Cryopreservation of Babesia bigemina for in vitro cultivation".Am. J. Vet. Res. 1985b; 46:421-423. 177
11. Extracción de ADN de hemoparásitos Juan Joel Mosqueda Gualito 11.1. Introducción Actualmente, el diagnóstico de muchas enfermedades parasitarias está basado en el análisis de ácidos nucleicos, específicamente el ADN. Las técnicas moleculares como el PCR, permiten analizar cantidades muy pequeñas de ADN, de tal manera que se permite la identificación de agentes parasitarios en cantidades no detectadas por métodos convencionales (Weiss 1995; Prichard 1997; Singh 1997; Zarlenga and Higgins 2001) . Para poder analizar el ADN de los parásitos de interés es necesario, en la gran mayoría de los casos, extraerlo de los tejidos y las células y agregarlo en forma pura y en cantidades conocidas. Por lo tanto, una característica importante del ADN analizado mediante este tipo de pruebas es su calidad y pureza; es por esto que el método de extracción de ADN es fundamental para asegurar el éxito de la prueba (Watson, Gilman et al. 1998; Bartlett 2003). Un ADN de mala calidad, es decir que esté parcialmente degradado, no podrá ser analizado; por otra parte, si éste viene contaminado con otros agentes químicos utilizados durante la extracción o con proteínas, no podrá ser cuantificado correctamente o bien estas sustancias inhibirán la reacción de PCR o terminarán degradando el ADN de la muestra. El ADN genómico es fácil de obtener en forma fragmentada, pero la dificultad de obtener ADN se incrementa conforme aumenta su tamaño y las moléculas de más de 150 kilobases (Kb) se fragmentan fácilmente por fuerzas generadas durante procesos usados comúnmente para su purificación (Sambrook and Russell 2001) . 11.2. Fundamento de la manipulación del ADN La extracción de ADN está basada en tres pasos fundamentales que son la homogenización, la separación y la purificación. Cada una de ellas es importante para asegurar la calidad de ADN de la muestra (Sambrook, Fritsch et al. 1989). La homogeinización es el primer paso en el proceso de extracción de ADN y consiste en disgregar la estructura tisular y celular con el objetivo principal de facilitar la liberación de los ácidos nucleicos. La homogeinización se puede realizar mediante métodos físicos como el macerado, la sonicación, la ebullición, la congelación-descongelación o el choque osmótico; métodos químicos como el uso de detergentes (principalmente SDS); o biológicos como el uso de proteinasas como la proteinasa K, la lisozima, etc. La idea es romper el tejido de forma mecánica y posteriormente liberar los ácidos nucleicos de las células lisando las membranas con detergentes y enzimas; éstas últimas además destruyen los complejos núcleo-proteicos, incrementando la pureza del ADN. El método de homogeinización a utilizar depende principalmente del tipo de tejido del cual se quiera extraerADN; si es de parásitos completos como 178
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Infección baja 1/400 huevos por gr
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