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e) Solución de bloqueo, leche descremada al 5 %. Leche descremada…………………………… 1 g SSAF 1X Tween 20………………………….20 mL Se disuelve la leche en SSAF 1X Tween 20, esta cantidad es suficiente para una placa y se prepara al momento en que se va a utilizar. f) Solución amortiguadora de Tris pH 9.5. Trizma base C4H11NO3a0.1 mM…………...............21.11 g Cloruro de magnesio anhidro Mg CL2 a 50 mM………4.7 g Cloruro de sodio NaCl……………………………………2.92 g Agua destilada……………………………………………1000 mL Disolver en 800 mL de agua destilada el MgCl2 y una vez disuelto se agrega el NaCl y al final el C4H11NO 3, ya disueltos se ajusta el pH a 9.5 y se afora a 1000 ml y se guarda a 4 ºC. F.- Soluciones utilizadas para electroforesis de los productos de PCR En la electroforesis de los productos de PCR la agarosa comúnmente se emplea para la elaboración de geles. Una vez polimerizados, los geles pueden ser empleados para separar fragmentos de DNA. La electroforesis utiliza un campo eléctrico para separar moléculas de diferente tamaño las cuales al pasar por el gel las más pequeñas se mueven más rápido que las grandes. El agar del gel de agarosa es elaborado de algas marinas altamente purificadas empleadas para separar moléculas de DNA con rangos de longitud desde 100 hasta de 10, 000 nucleótidos. El gel es sumergido en una cámara con la solución TBE.5x que conduce la corriente eléctrica. Las muestras de DNA (puede ser un producto de amplificación por PCR) son depositadas en los pozos elaborados previamente con peines especiales introducidos en la agarosa y se le adiciona un buffer de carga adicionado con dos colorantes que dejan una banda visible color azul para saber cuánto se ha separado la muestra. Los grupos fosfato en la estructura de DNA se cargan negativamente debido a las cargas negativas que le otorga el oxígeno al grupo fosfato, el DNA se mueve atraído por el polo positivo cuando se somete a un campo eléctrico. En la elaboración del gel se adiciona un colorante que se vuelve fluorescente cuando se intercala con el DNA (Bromuro de Etidio que se une estrechamente a la doble hélice del DNA), el complejo emite luz en la región visible del espectro cuando es excitado por luz ultravioleta, lo que permite observar la separación de los fragmentos de DNA. a) TBE 5x Tris base molecular SIGMAChemical Co……………54 g Acido bórico Electrophoresis Reagent SIGMA………27.5 g EDTA0.5 M pH 5……………………………………… 20 mL 225
) EDTA (0.5 M pH 8) Disodio EDTA2H2O SIGMAChemical Co………… 186.1 g Agua destilada……………………………………………800 mL Agitar vigorosamente y ajustar el pH a 8 c) TBE 0.5x TBE 5x…………………………………………………100 mL Agua mQ esterilizada………………………………...900 mL Mezclar el TBE 5x con el agua mQ y aforar a 1000 ml d) BROMURO DE ETIDIO (10 mg/ml) Bromuro de etidio………………………………………1 g H O……………………………………………………100 mL 2 Mezclar con un agitador magnético durante algunas horas y almacenar en un recipiente de aluminio o un frasco oscuro e) AGAROSA 1 % TM Agarosa GIBCOBRL ultra PURE LIFE TECHNOLOGIES…………….. 1 g TBE 0.5x………………………100 mL Pesar 1gdeagarosa y mezclar con el TBE 0.5x. Calentar la mezcla hasta derretir todos los grumos. e) AGAROSA2 % TM Agarosa GIBCOBRL ultra PURE LIFE TECHNOLOGIES…………….. 2 g TBE 0.5x………………………100 mL Pesar 2gdeagarosa y mezclar con el TBE 0.5x. Calentar la mezcla hasta derretir todos los grumos. G- Soluciones varias a) Jugo gástrico artificial Se utiliza para el diagnóstico de larvas histotrópicas de nemátodos gastroentéricos, además de ser ampliamente empleada para el diagnóstico de la triquinelosis Pepsina……...............................6 g Ácido clorhídrico.........................7 mL Agua destilada......cbp................1000 mL 226
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Autores Jesús Antonio Álvarez Mar
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Larva infectante de Bunostomum spp
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Larva infectante de Ostertagia - Te
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Larva infectante de Mecistocirrus d
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