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esplenectomizados. Para el cultivo in vitro. Un vial de B. bigemina y/o B. bovis
(que se mantuvieron en congelación en nitrógeno liquido), se descongela y se
le adiciona medio de VYM (Vega et al. 1985a,b), se centrifuga a 1000 x g por
10 minutos, después de la centrifugación, del paquete de eritrocitos se toma
0.1 mL y se adiciona 1 mL de medio de cultivo que contiene 0.600 ml de medio
199 y 0.400 ml de suero normal de bovino y 5% de eritrocitos normales, se
coloca en un pozo de una placa para cultivo celular de 24 pozos, y se
incuban
a 37°C en una atmósfera de 5% de CO 2, 5% de O2y90% N 2.
El medio de cultivo es reemplazado cada 24 h, realizando sub-cultivos
cada 72 h hasta que se tenga un porcentaje de eritrocitos parasitados
superior al 4%. La sangre infectada obtenida del cultivo in vitro,
se
centrifuga a 1340 x g durante 20 min a 4°C; se desecha el
sobrenadante y el paquete de eritrocitos se lava por centrifugación a
1340 x g durante 20 min a 4°C con medio de VyM, se desecha el
sobrenadante y se repiten los lavados 2 veces más, los eritrocitos se
resuspenden en medio de VyM adicionado con 0.5% de albúmina
sérica bovina y con esta suspensión se elaboran frotis procurando
cubrir la mayor superficie del portaobjetos, luego se dejan secar a
temperatura ambiente durante una hora; después se empaquetan, se
rotulan y se mantienen en congelación a -20°C hasta su uso.
Para la obtención de eritrocitos infectados por el segundo método, se
requiere un becerro esplenectomizado, al que se le inocula con 15 ml
de sangre infectada con Babesia spp, se suministran 7.5 ml por vía
intra-muscular y 7.5ml por vía intravenosa. Diariamente el animal es
monitoreado registrando su temperatura rectal; además de tomarle
muestras
sanguíneas y por la técnica de micro-hematocrito determinar el
volumen celular aglomerado (VCA), y realizar frotis sanguíneos los cuales
serán teñidos con colorante Giemsa, con el fin de determinar la presencia del
parásito. Cuando se obtenga una parasitemia mayor de 2.5%, se colectará
sangre desfibrinada utilizando un matraz de Kitazato al vacío con perlas de
vidrio.
La sangre infectada con Babesia spp. se centrifuga a 1340 x g durante 20
min a 4°C, se desecha el plasma y la capa flogística, el paquete de
eritrocitos se lava por centrifugación a 1340xg durante 20 min a 4°C con
medio de VyM, se desecha el sobrenadante y se repiten los lavados 2
veces más. Los eritrocitos se resuspenden en medio de VyM adicionado
con 0.5% de albúmina sérica bovina, y se preparan las laminillas como en
el caso anterior.
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