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1:3000 y para animales de laboratorio 1:1000. El reconocimiento de la
interacción antígeno-anticuerpo, se realizará directamente por
quimioluminiscencia o por adición de un cromógeno enzimático
especifico (Anexo 1)
9.2.2.4 ANÁLISIS INDIRECTO DE LA ENZIMA LIGADA A UN
INMUNOABSORBENTE INERTE (ELISA). Debido a su alto grado de
sensibilidad y especificidad la técnica de ELISA es confiable y de uso
común. La técnica de ELISA cuenta con otras variedades para su uso
en campo como son la técnica de Difusión en gel-ELISA (DIG-ELISA)
en caja Petri y técnica en papel de nitrocelulosa, (ELISA-punto) DOT-
ELISA. VerAnexo para la preparación de solución.
9.2.2.5 DIFUSIÓN EN GEL-ELISA (DIG-ELISA). Adicionar 10 ml de antígeno
(10 μg por ml) e incubar por 12 h a TA con buffer pH 9.6. Posterior a
cada paso, lavar 3 veces con 15 ml de SSAFT. Posteriormente, el agar
bacteriológico (1%) con leche descremada se vierte formando una
delgada capa (0.5mm) de agar sobre la caja Petri de 10 cm. dejar
melificar por 10 min. Realizar perforaciones homogéneas sobre el agar
de 3 mm aproximadamente y adicionar el suero primario y sueros
controles sin diluir por 12 h a TA. Posteriormente, incubar con
peroxidasa a 1:3000 y 1:2000 de conejo anti-ovino IgG (uso comercial)
para H. contortus y F. hepatica,
respectivamente. Después de los
lavados, agregar agarosa al 0.75% en solución de citrato pH 5.0,
mezclando con el sustrato, OPD ó ABTS a TA. Los resultados de
lectura se realizarán 20 min después, con una regla transparente,
medir el diámetro de los círculos amarrillo-naranja. (Bautista et al.,
1989)
9.2.2.6 ELISA Indirecta en placas de 96 pozos.
La reacción se realiza en
placa de polystirene de 96 pozos. La concentración seleccionada de
antígeno de extracto/crudo de H. contortus o de D. viviparus es de 2μg a
5μg de proteína por ml, respectivamente. Adsorber el antígeno a la
placa con solución de carbonato pH 9.6 ó por 12 h a 4C ó con SSAF pH
7 por 2 h a 37C. La interacción primaria antígeno-anticuerpo 1:100 se
realizara por 2h a TA y el conjugado se incuba por 45 min a la misma
dilución que en DIG-ELISA. La reacción se observará entre 10 y 45 min
después de adicionar el sustrato enzimático, leer en espectrofotómetro
(405 nm, utilizandoABTS) para placas de ELISA.
9.2.2.7.DOT-ELISA. El ensayo inmunoenzimático se realizará en papel de
0.45 de nitrocelulosa. La técnica se puede realizar en círculos de 5 mm
ó en tiras de papel de 10 mm x 2 cm. El tiempo de incubación para cada
paso en DOT-ELISA es de 30 min. Se adiciona 10 μl de proteína pura o
a concentración de 30μg por ml. Lavar extensivamente y colocar la
solución de bloqueo (ver Anexo 1), la cual puede cubrir todo el papel ó
solo el sitio donde se coloco la muestra. Posteriormente, colocar 10 μl
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