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determinar concentraciones reducidas de ADN y de ser un método confiable
sólo en un rango limitado de concentraciones (5 a 90 μg deADN/ml).Además a
260 nm también otras moléculas como el ARN, el fenol y el EDTA tienen
máxima absorción, y si e ADN está contaminado con estas moléculas, la
cuantificación será errónea. La concentración de ADN también puede
determinarse mediante un trans-iluminador de UV usando diluciones
conocidas de ADN y tiñéndolo con bromuro de etidio a una concentración de
0.5 μg/ml (Sambrook and Russell 2001).
11.3. Consideraciones sobre la manipulación del ADN
El método de extracción de ADN depende de varios factores, principalmente,
la aplicación, el tiempo, el costo y el tipo de muestra. Cuando se requieren
volúmenes grandes de ADN de pocas muestras, el método tradicional de
fenol-cloroformo es preferible; sin embargo éste método tiene tantos pasos (lo
cual resulta en un método largo) que resulta impráctico cuando se procesan
muchas muestras simultáneamente. En la actualidad hay muchas compañías
que ofrecen kits basados en membranas de resinas para la extracción de ADN
de diferentes tejidos, incluyendo sangre, los cuales son rápidos, con
protocolos fáciles de realizar y que permiten trabajar con un número de
muestras muy elevado al mismo tiempo. Sin embargo, son los métodos más
costosos y la cantidad de ADN purificada es muy poca debido a la capacidad
de la membrana utilizada. Todo esto debe tomarse en cuenta cuando se escoja
el método de extracción. Recientemente algunas compañías has desarrollado
métodos de extracción de ADN que no utilizan fenol ni cloroformo y que no son
a base de columnas de afinidad, lo cual permite obtener ADN en grandes
cantidades y de muy buena calidad e integridad en un tiempo reducido. Uno de
ellos es el “Puregene DNA extraction kit” de la compañía Gentra Systems,
ahora QIAGEN (QIAGEN 2007), el cual se ha utilizado con éxito para purificar
ADN de organismos patógenos sanguíneos como Anaplasma marginale y
virus de diferentes tejidos incluyendo sangre (Fahle y Fischer 2000; Brayton et
al. 2001).
El tipo de tejido de donde se extrae el ADN es lo más importante a considerar.
Por ejemplo, cuando se extrae ADN de Babesia spp. o de Anaplasma
marginale que se encuentran en los eritrocitos, la idea es eliminar la mayor
cantidad de células nucleadas de la sangre (glóbulos blancos) y dejar
únicamente los eritrocitos parasitados. Después se pueden eliminar la
mayoría de los eritrocitos ya sea por lisis por choque osmótico, por
congelación-descongelación y centrifugación (Figueroa et al. 1996). Cuando
se desean extraer ácidos nucleicos de parásitos extracelulares o se desean
purificar únicamente los parásitos intraeritrcíticos, se pueden purificar de las
demás células de la sangre por gradientes de densidad y a partir de las células
purificadas se puede hacer la extracción deseada (Rodriguez et al. 1986; Vega
et al. 1986; Mosqueda et al. 2004). Si los parásitos se encuentran en tejidos del
vector, como las garrapatas, se pueden macerar las garrapatas completas o,
idealmente, separar los tejidos específicos y con ellos hacer la extracción de
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