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10.3. Toma de la muestra:
Para realizar la prueba de inmunofluorescencia indirecta se requiere suero.
En los bovinos la colecta de sangre para la obtención del suero, por lo tanto
tomaremos aproximadamente 5 ml sin adicionar ninguna anticoagulante, se
podrá hacer con una jeringa, depositando su contenido en otro tubo de ensaye
limpio o con equipo “Vacutainer”. Se deja reposar el tiempo suficiente para que
se forme el coágulo, el cual se puede retirar con un palillo y el suero se decanta
a un tubo limpio. En todos los pasos es importante rotular los tubos con la
identificación del animal y los datos que se requieran para un buen manejo de
la muestra, el suero se guarda en congelación hasta su uso.
10.4. Desarrollo de la prueba:
Se saca el antígeno del congelador y se pone a desecar durante 30 minutos en
un matraz kitasato con cloruro de calcio (CaCl 2)
conectado por medio de un
tubo flexible a una bomba de vacío con presión negativa, enseguida se fija y se
hace permeable las membranas del antígeno sumergiéndolo en acetona
durante 15min. Posteriormente se procede a marcar con lápiz graso doce
círculos de aproximadamente 10 mm. de diámetro, según se aprecia en la
Figura 10.3.
Figura 10.3. Apariencia del frotis de anfígeno de IFI, mostrando
la distribución de los círculos marcados con lápiz graso.
En el centro del primero de los círculos se colocan 7 μl del suero control
positivo, en el circulo de abajo el suero control negativo, y en los demás
círculos los sueros problema, todos diluidos 1:80 en una solución buffer salina
1
de fosfatos (PBS)1X , adicionando 5% de suero de conejo como que actuara
como bloqueador de reacciones inespecíficas evitando que se mezclen los
sueros del ensayo, manteniendo la posición horizontal del portaobjetos. Éstos
se incuban durante 30min en una cámara húmeda a 37°C, se realizan 3
lavados con PBS1x/Tween 20 al 0.01% en agitación suave durante 5 min.
Posteriormente se coloca en cada uno de los círculos 7 μl de IgG de conejo anti
bovino conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) previamente
titulado; (para lo cual se harán diluciones del conjugado de 1:100 hasta
1:10,000 en PBS, realizando la prueba con sueros positivos y negativos para
encontrar la dilución de trabajo) adicionando 5% de suero de conejo como
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