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ecomienda usar inhibidores enzimáticos a 0.1mM phenilmethilsulfonil fluoride
ó 1 mM de N-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone disueltos en Isopropanol.
Macerar la muestra, procurando no generar calor, centrifugar a 3000 y 10,000
rpm a 4C por 10 min. La obtención de proteínas se deberá realizar de 20,000 a
100,000 rpm por 30 min a 4C y conservar el sobrenadante a –70C (Gamble &
Mansfield, 1992; Munn et al.,
1993; Lopez de Mendoza, 1999).
El perfil de proteínas se podrá observar en geles de poliacrilamida (SDS-
PAGE), la concentración del gel variará entre 4-6% para el superior y de 8 a 15
% para el inferior (Anexo 1) dependiendo de cada laboratorio.
ANTÍGENOS DE SUPERFICIE: Las moléculas de superficie (S) de
nematodos parásitos en rumiantes son claves para iniciar la interacción
hospedero-parásito. Existen numerosas moléculas que conforman a la
superficie de helmintos son: epidermis, mesodermis e hipodermis. Los
productos de S son obtenidos principalmente de los diversos estadios
infectantes de los helmintos se realiza por el uso de sustancias químicas
eliminadas por la mayoría de helmintos, y por sustancias propias del
hospedero. Por ejemplo, la adición in vitro de pH acido (2 a 4) o tripsina, los
cuales simulan el pH en abomaso de rumiantes, cerdo y humanos,
contribuyendo a la liberación de las capas superficiales de los nematodos
Haemonchus spp y Trichinella spp y del trematodo, Schistosoma spp liberando así
las moléculas de S que podrían ser empleadas como antígenos (Lopez de
Mendoza et al.
2000).
Los antígenos de S podrán ser colectados usando los siguientes agentes
solubles:
1. Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) a concentración de 0.25% al
0.5%
2. 10 mM 2-mercaptoethanol y sodium
3. Duodecyl sulphate (SDS) al 0.1%,
Se disuelve el agente soluble en SSAF pH 7 por un periodo de 2 a 12 h a 37C.
En caso de las larvas infectantes (L 3)
de Haemonchus sp,
estas serán incubadas
a 37 C por 4 h con 0.1% de CTAB. La muestra se podrá dializar para concentrar
y eliminar el agente reductor. Posteriormente, se realizará la centrifugación de
20,000 a 50,000 rpm a 4C por 30 min. El sobrenadante se colectara y se
conservara a -70C hasta su uso (Cox et al., 1989). Se recomienda concentrar
la muestra, utilizando membrana de diálisis* ó poly-ethilene glycol ó tubos
concentradores de proteínas (diferentes marcas, por ejemplo Millipore) a 4C y
centrifugación.
*NOTA: EL TAMAÑO DE PORO DE LA MEMBRANA DEPENDERÁ DEL
PESO MOLECULAR DE LAPROTEÍNA
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