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seguida por 15 min en congelación antes de su uso. Las condiciones óptimas
de PCR se establecerán con base en la metodología descrita por Silvestre &
Humbert (2000), Sambrook et al.,(1989) y Elard et al.,
(1998) . Se mezclará 7 l
de larvas digeridas, 1 U de Taq polimeraza, 2.5 ul de buffer 10x, 1 mM de
MgCl 2,
0.1 de dNTP y 18 pmol de cada iniciador. Las muestras serán
amplificadas iniciando con 4 min a 94C. seguida por un ciclo de 40 a 94C por 30
sec, el alineamiento se realizará a 57C por 30 sec y la extensión se realizará a
72C por un min. El paso final se realizará a 72C por 5 min. La presencia deADN
será confirmada por geles de agarosa al 1% con bromuro de etidio.
Los geles de agarosa serán preparados como se describe a continuación:
BUFFER TAE (10X)
40mM Tris-Acetato
1 mM EDTA, pH 8.0
1.- Disolver 48.4 g de Tris base en 800 mL de agua bidestilada (bd).
2.- Agregar 11.4 mL de Ácido acético glacial y 50 mL de EDTA (200 mM, pH
8.0).
3.- Aforar a1L.
EDTA 200 mM
a) Disolver 37.22 g de EDTA (ácido etilendiaminotetracético) en
400 mL de agua bi-destilada.
b) Ajustar a pH 8.0
c) Aforar a 500 ml
Preparación de geles de agarosa
1.- Pesar:
Gel 1%
Gel 1.5%
0.30 g deAgarosa
0.45 g deAgarosa
2.-Adicionar laAgarosa a 30 mL de Buffer TAE (1X)
3.- Disolver en horno de microondas (debe verse traslucida), el tiempo es de
aproximadamente 15 segundos.
4.- Dejar enfriar un poco
5.-Añadir 1.5 μl de Bromuro de Etidio (EtBr)
6.- Homogenizar bien
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