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teniendo mucho cuidado de no tocar la interfase; a veces es preferible
dejar un poco del volumen de la fase acuosa para no contaminar la
muestra con proteínas de la interfase.
Nota: Las fases deben estar bien separadas. Si el ADN se observa
viscoso o contiene una gran cantidad de proteína, se debe centrifugar
uno o dos minutos más (Sambrook and Russell 2001).
10. Repetir los pasos 8-11 hasta que se obtenga una fase acuosa clara.
Estos lavados son muy importantes cuando se extrae ADN de sangre
ya que los eritrocitos contienen mucha hemoglobina que es difícil de
eliminar.
11. Precipitar el ADN de la fase acuosa obtenida mezclándola con 2
volúmenes de etanol absoluto frío e incubar en CO2 sólido por cinco
minutos. También se puede incubar a -20 °C toda la noche o se puede
incubar la muestra a -70 °C por un par de horas.
12. Centrifugar las muestras a máxima velocidad por 30 minutos a 4ºC. El
ADN precipitado, usualmente invisible antes de la centrifugación,
forma una pastilla al fondo y a los lados del tubo.
13. Decantar el sobrenadante muy cuidadosamente para no perder la
pastilla.
14. Lavar el ADN una vez con 500 μl de etanol al 70% mantenido a
temperatura ambiente.
15. Mezclar las muestras con un vortex y centrifugar máxima velocidad
por 10 minutos a 4°C.
Para disolver elADN:
16. Secar la pastilla brevemente por 15 a 20 minutos en una campana de
flujo laminar o bien en un una centrífuga al vacío. Secar demasiado el
ADN dificultará la re-suspensión posterior de este (Bartlett y White
2003).
17. Disolver el ADN en agua libre de DNasas pasándolo varias veces por
una punta de micro-pipeta, e incubándolo por 10 min a 55 °C.
18. Determinar la cantidad deADN por espectrofotometría.
Protocolo 2.
Pasos para la extracción de ADN de garrapatas Boophilus spp.
infectadas con Babesia spp., utilizando el método de fenol-cloroformoalcohol
iso-amílico.
1. Obtener los parásitos para su maceración en un mortero. El número
varía según el tamaño y edad de las garrapatas, pero preferentemente
no usar más de 1 g de larvas ( ≤20000
larvas) o dos o tres garrapatas
adultas. Idealmente los parásitos, ya sea larvas o adultos deben haber
sido previamente congelados a -70 °C. Si son garrapatas adultas,
ayuda si éstas han sido evisceradas con anterioridad para eliminar el
exoesqueleto.
2. Mantener el mortero y su pistilo también a -70 °C. Si no se cuenta con
un ultra-congelador, se puede preparar un baño de CO2 sólido y
metanol y dejarlo a que alcance una temperatura estable. Dentro del
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