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helmintos o bien de órganos o tejidos donde se alojen los parásitos, se deben
de utilizar métodos de homogeinización más fuertes como el macerado y la
ebullición. Si se trata de parásitos unicelulares purificados o de parásitos
localizados en la sangre, los métodos son enfocados a lisar las células y liberar
los ácidos nucleicos utilizando SDS y digestión enzimática. El principal
problema durante la homogeinización esque no se logra liberar el ADN
totalmente y aún se encuentra contaminado principalmente con proteínas.
Este es la principal causa de fracaso durante la extracción y si hay
contaminación con proteínas o tejidos completos al final de este paso, en los
pasos siguientes será imposible liberar el ADN de estos contaminantes y se
tendrá, en su defecto que repetir todo el proceso, como se explica en las
siguientes secciones, lo cual incrementa el tiempo y el consumo de reactivos.
Sin lugar a dudas, una combinación de dos o más métodos de
homogenización siempre será mejor que un solo método. Un punto importante
a considerar es la adición de EDTA, el cual inhibe las nucleasas, enzimas que
degradan los ácidos nucleicos (Sambrook and Russell 2001). Un vez que el
ADN ha sido liberado, se procede al siguiente paso de separación.
Durante la separación se pretende disociar elADN de los demás componentes
celulares; para esto se utilizan principalmente agentes orgánicos como el
fenol, aunque también se utilizan el cloroformo y el alcohol iso-amílico (Moore
y Dowhan 1998). El fenol es un agente desnaturalizante de las proteínas que
facilita su remoción de los ácidos nucleicos durante el proceso de extracción
(Kirby 1957). El cloroformo también desnaturaliza las proteínas además de
estabilizar la interfase, reduciendo la cantidad de fase acuosa retenida en la
fase orgánica, incrementando así la densidad de la mezcla y facilitando la
remoción de lípidos. Finalmente, el alcohol iso-amílico ayuda a la separación
de proteínas desnaturalizadas e incrementa la separación de fases (Ambion
2007). El resultado es la formación de tres fases en la mezcla: una fase
superior acuosa conteniendo los ácidos nucleicos (ADN y ARN), una fase
intermedia conteniendo proteínas y complejos núcleo-proteicos y una fase
inferior orgánica conteniendo los agentes orgánicos e impurezas (Sambrook y
Russell 2001).
Otro método de separación de ADN incluye el uso de membranas que
funcionan mediante cromatografía de intercambio ónico con resinas a base de
grupos cationes como el dietilaminoetil (DEAE) (Budelier y Schorr 1998). El
fundamento de las resinas se basa en la interacción entre los grupos fosfato de
la cadena de ADN que están cargados negativamente, y los cationes de la
membrana. Mediante lavados con soluciones de diferentes concentraciones
de sales, se puede controlar la unión, la astringencia y la elusión del ADN de la
membrana (QIAGEN 2003). Los métodos basados en este principio tienen la
ventaja de no usar agentes orgánicos como el fenol o el cloroformo que son
muy tóxicos y que requieren procedimientos especiales para su manejo,
almacenaje y eliminación en cualquier laboratorio (Sambrook y Russell 2001).
La idea de la separación es eliminar la mayoría de las proteínas y otros
contaminantes de la fase donde se mantiene el ADN; sin embargo siempre
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