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e) Solución de bloqueo, leche descremada al 5 %.
Leche descremada…………………………… 1 g
SSAF 1X Tween 20………………………….20 mL
Se disuelve la leche en SSAF 1X Tween 20, esta cantidad es suficiente para
una placa y se prepara al momento en que se va a utilizar.
f) Solución amortiguadora de Tris pH 9.5.
Trizma base C4H11NO3a0.1 mM…………...............21.11 g
Cloruro de magnesio anhidro Mg CL2 a 50 mM………4.7 g
Cloruro de sodio NaCl……………………………………2.92 g
Agua destilada……………………………………………1000 mL
Disolver en 800 mL de agua destilada el MgCl2 y una vez disuelto se agrega el
NaCl y al final el C4H11NO 3,
ya disueltos se ajusta el pH a 9.5 y se afora a 1000
ml y se guarda a 4 ºC.
F.- Soluciones utilizadas para electroforesis de los productos de PCR
En la electroforesis de los productos de PCR la agarosa comúnmente se
emplea para la elaboración de geles. Una vez polimerizados, los geles pueden
ser empleados para separar fragmentos de DNA. La electroforesis utiliza un
campo eléctrico para separar moléculas de diferente tamaño las cuales al
pasar por el gel las más pequeñas se mueven más rápido que las grandes. El
agar del gel de agarosa es elaborado de algas marinas altamente purificadas
empleadas para separar moléculas de DNA con rangos de longitud desde 100
hasta de 10, 000 nucleótidos. El gel es sumergido en una cámara con la
solución TBE.5x que conduce la corriente eléctrica. Las muestras de DNA
(puede ser un producto de amplificación por PCR) son depositadas en los
pozos elaborados previamente con peines especiales introducidos en la
agarosa y se le adiciona un buffer de carga adicionado con dos colorantes que
dejan una banda visible color azul para saber cuánto se ha separado la
muestra. Los grupos fosfato en la estructura de DNA se cargan negativamente
debido a las cargas negativas que le otorga el oxígeno al grupo fosfato, el DNA
se mueve atraído por el polo positivo cuando se somete a un campo eléctrico.
En la elaboración del gel se adiciona un colorante que se vuelve fluorescente
cuando se intercala con el DNA (Bromuro de Etidio que se une estrechamente
a la doble hélice del DNA), el complejo emite luz en la región visible del
espectro cuando es excitado por luz ultravioleta, lo que permite observar la
separación de los fragmentos de DNA.
a) TBE 5x
Tris base molecular SIGMAChemical Co……………54 g
Acido bórico Electrophoresis Reagent SIGMA………27.5 g
EDTA0.5 M pH 5……………………………………… 20 mL
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