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9.2.2.1. INMUNODIFUSIÓN SIMPLE/DOBLE EN AGAR:
Es el equilibrio
molecular que se observa en la interacción antígeno-anticuerpo sobre
una delgada malla de gel. Ambas muestras son atraídas por afinidad
iónica, lo cual tiende a precipitar las moléculas cuando se encuentran en
medio isotónico.
a. La reacción se detecta en 0.75% de agarosa diluida en 0.85% de
solución salina en placas Petri de 10 cm de diámetro ó sobre
portaobjetos nuevos.
b. Procedimiento: Distribuir la agarosa en la placa/portaobjetos a
temperatura de 18C, evitando burbujas y permitir que enfríe por
15 min a temperatura ambiente (TA). Formación 6 pozos de 10 x
20 mm de diámetro; uno en el centro y 5 alrededor. Una muestra
se coloca en el centro para que migre pasivamente hasta
interaccionar con la muestra heteróloga correspondiente,
entonces se llevara a cabo la precipitación
9.2.2.2. ELECTROFORESIS Y WESTERN BLOT.
Se conoce como
electroforesis al movimiento de partículas cargadas bajo la influencia de
un campo eléctrico. Las moléculas que componen los antígenos son de
diferente tamaño y presentan diferente carga neta, por lo cual la
velocidad de migración depende de factores como pH, concentración
del medio, temperatura e intensidad del campo eléctrico (Laemli, 1970).
Algunos ejemplos son: inmunoelectroforesis y electroforesis en geles de
poliacrilamida con agentes reductores cono el sodium duodecyl
sulphate (SDS-PAGE), (Munn et al., 1987; Roitt et al,
1996).
9.2.2.3. SDS-PAGE y WESTERN BLOT t. La detección de la reacción
antígeno-anticuerpo en SDS-PAGE, tiene diversas aplicaciones, como
es la determinación del perfil y transferencia de proteínas o moléculas
de ácidos nucleicos. Al transferirse el patrón de proteínas del gel de
SDS-PAGE a membrana de nitrocelulosa (NC) se denominará Western
blot, siguiendo el principio de carga iónica. Transferidas las moléculas,
se podría realizar la inmuno-electrotransferencia para detección de la
interacción antígenos-anticuerpo. El Anexo 1 muestra la preparación de
soluciones comúnmente usadas. A continuación se describen
generalidades del procedimiento:
* Utilizar de 40 a 60 μg de proteína contenida en 50 μL
*El tiempo de separación en mini-geles y transferencia es de 60 a 90
min a 25C. En caso de utilizar geles de mayor tamaño, separar
proteínas por 12 h/ 4C.
*Incubar la membrana de NC con el anticuerpo primario por 30 a 60
min. Realizar de 3 a 5 lavados con SSAF y Tween al 1%, y adicionar el
segundo anticuerpo marcado con una enzima (peroxidasa o alacalinfosfatasa)
durante 45 min. En caso de rumiantes, utilizar dilución
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