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grupo de investigación ha sido pionero (Figueroa et al., 1992; 1998; Ramos et
al., 1992; Figueroa et al., 1998). Se han reportado diferentes publicaciones de
PCR para discriminación entre aislados de Babesia bovis (Lew et al., 1997), se
han comparado con pruebas serológicas (Calder et al., 1996). Recientemente
se ha descrito un PCR en tiempo real para la cuantificación de infección en
sangre de bovino infectado y en hemolinfa de garrapatas (Howell et al., 2007).
En general esta metodología resulta en un alto costo además requiere equipo
y su ejecución puede considerarse sofisticada. Por lo que es necesario
mantener su precisión, efectividad, pero tratando de hacerla más eficiente.
Una posibilidad es adaptar los sistemas individuales a PCR multiplex, para
optimizar costo y tiempo usando la misma muestra y reactivos. Por lo que el
objetivo de este en estudio fue instrumentar un ensayo de PCR-duplex para la
identificación de portadores asintomáticos de Babesia bovis y Anaplasma
marginale.
12.2 Extracción ADN
Inicialmente se adiciono saponina previo a la extracción del ADN según se
descripción previa (Figueroa et al., 1993). Posteriormente se uso un kit
comercial, basado en el uso de columnas(Mo Bio U.S.A).
1. A 100l a de paquete de glóbulos rojos previamente lavados con
Pbs. agregar 250 al de buffer de lisis (0.015 % saponina, 35m M de
NaCl Y 1mMEDTA)
2. Agitar en vortex suavemente
3. Centrifugar a 10, 000 rpm x 5 min
4. Retirar sobrenadante con una punta y agregar al pellet
1 ml. de PBS
5. Centrifugar a 10,000 rpm x 2 min.
6. Repetir pasos 4y 5.
SEGUIR PROTOCOLO MO BIO PARA EXTRACCIÓN DE ADN NÚM DE
CAT. 12334-50
Agregar 1 ml. de la sol. de lisis TD1 al pellet
Homogenizar suavemente usando una punta
Transferir la muestra a una columna de extracción
Centrifugar 30 seg. a 10,000 RPM
Descartar buffer centrifugado
Agregar a la columna 400 al de la sol.
Repetir pasos 4 Y 5
TD2
Centrifugar 1 min. a 10,000 rpm para eliminar totalmente el
buffer TD2
Transferir la columna a un tubo nuevo
Agregar a la columna 50 de la sol. TD3 justo en el centro
Centrifugar 30 seg. a 10, 000 rpm
Descartar la columna
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