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Figura 13.3.3. Prueba de ICD. A, Patrón de colocación de los sueros; B, sugerencia del número de sueros a probar en una placa de poliestireno de 8.5 cm de diámetro. 14.4. Ensayo Inmunoenzimatico (ELISA). En los últimos años uno de los ensayos que más se han utilizado para la detección de anticuerpos IgG anti-O. ovis en ovinos y cabras es el ELISA utilizando diferentes antígenos (Goddard et al., 1999; Bauer et al., 2002; Papadoupolus et al., 2006; Angulo-Valadez et al., 2008). Sin embargo, este ensayo se puede llevar a cabo en laboratorio utilizando el antígeno de L2 (descrito en esta sección) diluidos a 2 μg/ml en buffer de carbonatos (0.015 M Carbonato de Sodio, 0.03 M Bicarbonato de Sodio, pH 9.6) y distribuidos en placas de 96 pozos (Nunclon surface, Nunc, Denmark). Se incuba por 1 hora a 37 ºC y luego toda la noche a 4 ºC. Los pozos se lavan tres veces con PBST (0.01 M fosfato, 0.15 M cloruro de sodio, pH 7.2 y 0.1% Tween 20). Los pozos cubiertos con antígeno se incuban 30 minutos a 37 ºC con una solución de leche descremada al 10% y luego se descarta la solución. Se adicionan muestras de suero diluido 1:50 (cabras) ó 1:200 (ovejas) en PBST y se lavan tres veces con PBST antes de adicionar el anticuerpo conjugado con peroxidasa (anti-IgG de cabra (No. #A5420) ó anti-IgG de oveja (No. #A3415), Sigma, St. Louis, MO) diluido 1:2000 en buffer de carbonatos (60 minutos de incubación a 37 ºC). Se hacen tres lavados finales con PBST antes de adicionar e incubar (37 ºC) 100 μl por pozo del cromógeno (0.4 mg/ml OPD (No. P5412) para cabras ó ABTS (No. P6782) para ovejas, Sigma, St. Louis, MO). Después de 1 hora, las densidades ópticas (DO) se determinan con un espectrofotómetro al medir la 213
absorbancia a 454 nm (cabras) 405 nm (ovejas). Se utilizan sueros negativo (animales no infectados con O. ovis) y positivo (animales infectados con O. ovis) se usaron como controles de referencia. Los resultados se pueden expresar como % del control positivo como sigue (Angulo-Valadez et al., 2008, 2009): (En general se acepta que un animal se puede considerar postitivo si el valor obtenido es mayor a 20% del control positivo) Literatura citada 1. 2. 3. 4. 5. 6. Anticuerpos (%) = DOmuestradesuero–DOcontrol negativo DO control positivo – DO control negativo ×100 Angulo-Valadez C.E., Cepeda-Palacios, R., Ascencio, F., Jacquiet, Ph., Dorchies, Ph., Ramírez-Orduña, J.M., López. M.A., 2009. IgG antibody response against salivary gland antigens from Oestrus ovis L. larvae (Diptera: Oestridae) in experimentally and naturally infected goats Vet. Parasitol., 161:356-359. Angulo-Valadez CE, Scala A, Grisez C, Prevot F, Bergeaud JP, Carta A, Cepeda-Palacios R, Ascencio F, Terefe G, Dorchies P, Jacquiet P. 2008. Specific IgG antibody responses in Oestrus ovis L. (Diptera: Oestridae) infected sheep: Associations with intensity of infection and larval development. Vet. Parasitol. 155:257-263. Bauer C, Steng G, Prevot F, Dorchies P. 2002. Seroprevalence of Oestrus ovis infection in sheep in southwestern Germany. Vet Parasitol. 110:137- 143. Bautista Garfias C.R. 2006. Entomología Veterinaria Esencial. Ed. INIFAP. México Bautista Garfias CR, Ruíz A, Morales F, Morilla A. 1982. Anticuerpos circulantes contra larvas de Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) en cabras México, D.F., 2006.infestadas naturalmente. Folia Entomol. Méx., 52: 75- 86. Bautista-Garfias CR., Angulo-Contreras, R.M., and Garay-Garzón, E., 1988. Serologic diagnosis of Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) in naturally infested sheep. Med. & Vet. Entomol., 2: 351-355. 214
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