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3.
Para obtener 20 μM se recomienda utilizar 2 μl para 100 μl de
reacción para finalmente tener 0.2 μM
La fórmula empleada requiere de la nM de los iniciadores (nmoles)
-6 -9
200 μM = 200 x 10 moles = nmoles x 10 nmoles
1000 x ml
-9
Donde: xml = ( nmoles x 10 moles) (1000 ml)
-6
200 x 10 moles
200 μM x ml = nmoles/200
Multiplicar los nanomoles del primer x 5 (es una constante) para
obtener la cantidad de agua en microlitros
nM x x (5) = 200 μM
Ej:60nMx5=300μldeagua
DETERMINACIÓN ESPECTROFOMÉTRICA DE ADN
La concentración de DNA se determina a 260 y 280 nm de una dilución
previamente establecida. La cantidad de ADN dependerá del total de ADN
colectado, en caso de estadios infectivos de helmintos se utilizan diluciones
que van de
- 1:100 a 1:200 y en caso de evaluar el ADN genómica de los hospedero
infectados se recomienda una dilución 1:40.
- Determinar la absorbancia de la dilución a 260 /280 nm. La lectura de
260 permite calcular la concentración de DNA en la muestra teniendo
en cuenta que 1 unidad de densidad óptica (OD) corresponde a 50 μg
por ml para ADN de doble cadena. La relación de la lectura a 260 nm
entre la lectura a 280 nm (OD 260/OD 280)
de un estimado de pureza de la
muestra de ADN. Preparaciones puras de ADN tienen valores > 1.8. Si
hay contaminación con fenol ó proteínas el valor de la OD es
significativamente menor que 1.8 y no es posible determinar con
exactitud la concentración de DNAen la muestra.
Concentración deADN =Ax f dilución x 50
Donde:A= absorbancia
f = factor de dilución
9.3.3. Descripción de la metodología para el diagnóstico de alelos
específicos asociados a la resistencia al grupo de bencimidazoles por
técnica de Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR)
Se empleará un paquete de 0.2 ml de L3 de nematodos sin vaina y la extracción
de ADN se realizará como se describe a continuación: 300 l de buffer de
extracción (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 5mg/ml de proteinaza K) se
mezclará con las L 3,
las cuales serán incubadas a 4C durante toda la noche.
Posteriormente, la proteinaza K se inactivará por incubación a 95C por 20 min,
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