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año se coloca el mortero y el pistilo hasta que alcancen la temperatura
de baño (ayuda si se mantienen previamente a -20 °C).
3. Agregar 10 volúmenes de búfer de extracción al mortero (quitar el
pistilo primero) y colocar los parásitos encima del búfer.
4. Pulverizar la muestra con el pistilo usando un movimiento circular
manteniendo el mortero firmemente y evitando tocar la cabeza del
pistilo con los guantes. La muestra está lista cuando se observe un
polvo fino y homogéneo.
5. Con una punta de 1000 μl, colectar la mezcla en tubos de 1.5 ml. No
agregar más de 700 μl por tubo.
6. Incubar las muestras homogenizadas por 5 minutos a temperatura
ambiente para permitir la disociación completa de los complejos
núcleo-proteicos.
7. Agregar Proteinasa K (100 μg/ml) e incubar toda la noche a 45 °C en
baño maría.
8. Agregar 1 volumen de fenol-cloroformo-alcohol iso-amílico y tapar los
tubos de forma segura.
9. Agitar suavemente los tubos durante 10 minutos.
10. Centrifugar las muestras en una micro-centrífuga a 3000 rpm durante
10 minutos a 15 °C.
11. Después de la centrifugación, la mezcla se separa en tres fases: una
fase clara superior, una interfase y una fase inferior turbia. El ADN
permanece en la fase acuosa. Transferir la fase acuosa a otro tubo,
teniendo mucho cuidado de no tocar la interfase; a veces es preferible
dejar un poco del volumen de la fase acuosa para no contaminar la
muestra con proteínas de la interfase.
Nota: Las fases deben estar bien separadas. Si el ADN se observa viscoso
o contiene una gran cantidad de proteína, se debe centrifugar uno o
dos minutos más (Moore y Dowhan 1998).
12. Repetir los pasos 8-11 hasta que se obtenga una fase acuosa clara.
13. Precipitar el ADN de la fase acuosa obtenida mezclándola con 2
volúmenes de etanol absoluto frío e incubar en CO2 sólido por cinco
minutos. También se puede incubar a -20 °C toda la noche o se puede
incubar la muestra a -70 °C por un par de horas.
14. Centrifugar las muestras a máxima velocidad por 30 minutos a 4ºC. El
ADN precipitado, usualmente invisible antes de la centrifugación,
forma una pastilla al fondo y a los lados del tubo.
15. Decantar el sobrenadante muy cuidadosamente para no perder la
pastilla.
16. Lavar elADN una vez con 500 μl de etanol al 70%.
17. Mezclar las muestras con un vortex y centrifugar máxima velocidad
por 10 minutos a 4°C.
Para disolver el ADN:
18. Secar la pastilla brevemente por 15 a 20 minutos en una campana de
flujo laminar o bien en un una centrífuga al vacío. Secar demasiado el
ADN dificultará la re-suspensión posterior de este (Bartlett and White
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