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9.3.1. EXTRACCIÓN DE ADN
1. UTILIZAR 5,000 larvas (L 3/L 4) ó adultos (1-20) de H. contortus
a. Macerar en mortero estéril a 4C
b. Romper la integridad de larvas por choque con nitrógeno
liquido
2. HOMOGENIZAR la muestra utilizar con 10 ml de solución de
extracción y 100 μg por ml de PROTEINAZA K, incubar a 45C la
muestra por 12 h en un tubo estéril
3. AGREGAR un volumen equivalente de FENOL/ CLOROFORMO/
ALCOHOL ISOAMÍLICO (24:25:1 v/v) agitar la muestra manualmente
y con cuidado por 10 min
4. CENTRIFUGAR la muestra a 3000 rpm durante 10 a 15 min a 4C
5. SEPARAR la muestra en tres fases: Fase blanquecina que se localiza
en la parte inferior (correspondiente al fenol-cloroformo); fase
intermedia, transparente y fase acuosa en la parte superior, dónde
permanece el DNA.
6. TRANSFERIR cuidadosamente la fase acuosa/superior a un tubo
limpio, cuidando de no tomar la interfase
7. HACER de 2 a 3 extracciones similares, hasta observar un color
transparente.
8. PRECIPITAR el DNA al adicionar dos volúmenes de etanol absoluto,
dejar a -20C toda la noche
9. CENTRIFUGAR la muestra en tubos estériles de 1.8 ml a 14 rpm por
60 min a 4C para que precipite el DNA. El DNA precipitado es difícil de
observar, se podría ver un botón traslúcido en el lado lateral del tubo, el
sobrenadante se elimina. También se podría no ver y perderlo, por lo
cual debe de tener cuidado al decantar.
10. LAVAR el botón de DNA con 0.5 ml de etanol al 70% agitar 10 min
manualmente de manera suave hasta obtener una emulsión completa
11. CENTRIFUGAR a 14 000 rpm por 10 min a 4C
12. SECAR el pellet a TAen la campana de flujo laminar por 30 min
13. RESUSPENDER en agua libre de DNA/RNAasa e incubar 10 min a 55
C
14. Conservar a -70C ó en nitrógeno líquido hasta su uso.
9.3.2. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE TEJIDO UTILIZANDO
REACTIVOS COMERCIALES
La extracción de tejido de larva y adulto DE H. contortus se ha realizado
a través de reactivos comerciales, los cuales, son productos
confiables en su mayoría para su uso. Asimismo, se sugiere que el
investigador/académico y estudiante seleccione el que mejor
procedimiento que se adapte a sus condiciones de trabajo. Asimismo,
las adaptaciones de los métodos de trabajo dependerán del equipo en
laboratorio.
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