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Les amorces utilisées pour amplifier le gène Cγ1 humain sont : • Gam1 CH1-5’F : 5’ CAATCGATGCCCGTGAGCCCAGACGAGCCCAGAC 3’ • Gam1 CH1-3’R ; 5’ GCTTCCAGCAGAGACACCCT 3’ • Gam1 CH2-5’F : 5’ CAGCTCGGACACCTTCTC 3’ • Gam1 CH2-3’R : 5’CCGGCCTCTGTCCATGTG 3’ • Gam1 CH3-5’F : 5’CACATGGACAGAGGCCGG 3’ • Gam1 CH3-3’R : 5’ CTGACCCGTGGAAAGAAC 3’ • Gam1 mbexon-5’F : 5’AGCTGACCTCAGGACATT 3’ • Gam1 mbexon-3’R : 5’ GCTCCCATCACGAAGTACAA 3’ La séquence de p-gamma1KI a été vérifiée par séquençage automatique et par analyse de restriction avec les enzymes ClaI et Xho I, confirmant que le vecteur était apte à permettre une recombinaison homologue telle que schématisée (Figure 1). Locus IgH murin ciblé Targeted mouse IgH locus Construction Igγ1 humain DQ52 DQ52 EcoRI 12kb M222 XbaI-EcoRI EcoRI JH Eµ Sµ Cµ EcoRI EcoRI Figure 1 : Représentation schématique de l’évènement de recombinaison homologue obtenu. 2) Transfection de cellules ES et injection dans des blastocystes Cγ1 Les clones de cellules ES ont été isolés, analysés puis injectés dans des blastocystes de souris C57/Black 6, en utilisant les protocoles classiques de transgénèse et d’analyse de l’ADN génomique, tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. 120 loxP loxP Recombinaison homologue NEO NEO 7,5kb loxP loxP JH Eµ Cγ1 Cµ Cδ M222 XbaI-EcoRI EcoRI Cδ
AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). De manière plus précise, des cellules ES ont été transfectées par électroporation de l’ADN de p-gamma1KI linéarisé au site Not I. Les clones sélectionnés en présence de généticine ont été prélevés et leur ADN digéré par EcoRI puis analysé par Southern Blot à l’aide d’une sonde radioactive s’hybridant en dehors du site de recombinaison homologue, en 5’ du gène constant IgH Delta (δ) et de son site EcoR I. λ Hind III N.D. Not I Figure 2 : A. linéarisation du vecteur avant transfection (ND, non digéré ; NotI, linéarisé par l’enzyme NotI); B. Southern blot d’un clone mutant (1) et de ses sous-clones (3 et 4) par comparaison à un ADN non muté (2) La présence d’un allèle recombinant est visualisée par un fragment d’environ 7,5 kb (représentant le fragment µ murin et la cassette néo) alors que l’allèle sauvage correspond à un fragment de 12 kb. Dans ces conditions, sur 192 clones analysés, 1 s’est révélé positif (n°153). La vérification du caryotype n’a montré aucune anomalie chromosomique (aneuploïdie). Ce clone a été injecté dans des blastocystes de souris C57/Black 6 en utilisant les protocoles classiques de transgénèse tels que ceux décrits dans Transgenic Mouse: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), V. 209.). Un ♂ chimère, présentant un degré de chimérisme élevé, a été obtenu et mis en accouplemement avec des ♀ C57/Black 6 afin d’obtenir des animaux hétérozygotes qui ont été analysés par PCR et ELISA. Une lignée de souris homozygotes pour le locus IgH recombiné, dénommée ci-après lignée gamma 1 knock-in ou γ1KI, a ensuite été obtenue par croisement des animaux hétérozygotes. 121 12 kb 7,5 kb 153 Sous-clones 1 2 3 4
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