Modèles transgéniques pour l'étude de la fonction ... - Epublications

AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). De manière plus précise, des
cellules ES ont été transfectées par électroporation de l’ADN de p-gamma1KI linéarisé au site
Not I. Les clones sélectionnés en présence de généticine ont été prélevés et leur ADN digéré par
EcoRI puis analysé par Southern Blot à l’aide d’une sonde radioactive s’hybridant en dehors du
site de recombinaison homologue, en 5’ du gène constant IgH Delta (δ) et de son site EcoR I.
λ Hind III N.D. Not I
Figure 2 : A. linéarisation du vecteur avant transfection (ND, non digéré ; NotI, linéarisé par l’enzyme
NotI); B. Southern blot d’un clone mutant (1) et de ses sous-clones (3 et 4) par comparaison à un ADN
non muté (2)
La présence d’un allèle recombinant est visualisée par un fragment d’environ 7,5 kb
(représentant le fragment µ murin et la cassette néo) alors que l’allèle sauvage correspond à un
fragment de 12 kb. Dans ces conditions, sur 192 clones analysés, 1 s’est révélé positif (n°153).
La vérification du caryotype n’a montré aucune anomalie chromosomique (aneuploïdie).
Ce clone a été injecté dans des blastocystes de souris C57/Black 6 en utilisant les
protocoles classiques de transgénèse tels que ceux décrits dans Transgenic Mouse: Methods and
Protocols (Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), V. 209.). Un ♂ chimère, présentant un
degré de chimérisme élevé, a été obtenu et mis en accouplemement avec des ♀ C57/Black 6 afin
d’obtenir des animaux hétérozygotes qui ont été analysés par PCR et ELISA. Une lignée de
souris homozygotes pour le locus IgH recombiné, dénommée ci-après lignée gamma 1 knock-in
ou γ1KI, a ensuite été obtenue par croisement des animaux hétérozygotes.
121
12 kb
7,5 kb
153
Sous-clones
1 2 3 4