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Marquage à l’aide d’anticorps fluorescents : - 10 5 cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 4° avec une dilution au 1/100 ème d’un anticorps anti-IgM de souris marqué à l’isothiocyanante de fluorescéïne (Southern Biotechnologies) et un anticorps anti-IgG humain couplé Alexa 633. - Les cellules ont ensuite été lavées dans 5ml de PBS. - Le surnageant a été décanté et les cellules ont été reprises dans 100 microlitres de PBS, 0,5% BSA, 0,1 mM EDTA Analyse en cytofluorimétrie : sur un cytomètre de flux COULTER XL. 6) Immunisation des animaux Les animaux ont été immunisés une première fois par injection intra-péritonéale de 20 microgrammes d’antigène P24 (protéine de la pepside VIH-1) diluée dans 200 microlitres de sérum physiologique et mise en émulsion avec 200 microlitres d’adjuvant complet de Freund (SIGMA) Toutes les 2 semaines, les animaux ont subi un rappel vaccinal par injection intra-péritonéale de 20 microgrammes d’antigène P24 diluée dans 200 microlitres de sérum physiologique et mise en émulsion avec 200 microlitres d’adjuvant incomplet de Freund (SIGMA). 7) Dosage des anticorps spécifiques de l’antigène P24 La présence d’anticorps spécifiques de l’antigène P24 a été recherchée par ELISA 2 semaines, puis 4 semaines après la deuxième injection de l’antigène suivant la technique suivante : - coating de plaques 96 puits (Maxisorb, NUNC) par incubation une nuit à 4° avec de l’antigène P24 à la concentration de 1 microgrammes/ml en tampon Carbonate 0,1 M pH 8,3 (100 microlitres/puits) - 3 lavages en PBS Tween 0,1% - saturation des plaques en milieu complet {PBS, 3% BSA}(100 microlitres/puits) - 3 lavages en PBS Tween 0,1% - distribution des sérums à tester dilés au 1/100 ème et au 1/200 ème en tampon {PBS, 1% BSA}(100 microlitres/puits) - incubation 3 heures à 37°C - 3 lavages en PBS Tween 0,1% 124
- distribution d’un antisérum anti-IgG humaines marqué à la phosphatase alcaline (monoclonal anti-human IgG-AP, SIGMA) dilué au 1/1000 ème (100 microlitres/puits) - 3 lavages en PBS Tween 0,1% - réaction enzymatique de révélation par addition de PNP en tampon TRIS 0,2M (Sigma) - blocage de la réaction par addition de soude 3N (30 microlitres/puits) - lecture en spectrométrie à une longueur d’onde d’absortion de 405 nm. - Le taux des anticorps IgG anti-P24 a été exprimé en unités arbitraires établies pour la moyenne des sérums dilués au 1/100 ème et 1/200 ème en fonction du rapport Densité optique sérum testé / Densité optique du sérum témoin. 125
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UNIVERSITE DE LIMOGES Ecole doctora
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de m’avoir donnée le goût pour
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