Modèles transgéniques pour l'étude de la fonction ... - Epublications
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Marquage à l’ai<strong>de</strong> d’anticorps fluorescents :<br />
- 10 5 cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 4° avec une dilution au 1/100 ème d’un<br />
anticorps anti-IgM <strong>de</strong> souris marqué à l’isothiocyanante <strong>de</strong> fluorescéïne (Southern<br />
Biotechnologies) et un anticorps anti-IgG humain couplé Alexa 633.<br />
- Les cellules ont ensuite été <strong>la</strong>vées dans 5ml <strong>de</strong> PBS.<br />
- Le surnageant a été décanté et les cellules ont été reprises dans 100 microlitres <strong>de</strong> PBS,<br />
0,5% BSA, 0,1 mM EDTA<br />
Analyse en cytofluorimétrie : sur un cytomètre <strong>de</strong> flux COULTER XL.<br />
6) Immunisation <strong>de</strong>s animaux<br />
Les animaux ont été immunisés une première fois par injection intra-péritonéale <strong>de</strong> 20<br />
microgrammes d’antigène P24 (protéine <strong>de</strong> <strong>la</strong> pepsi<strong>de</strong> VIH-1) diluée dans 200 microlitres <strong>de</strong><br />
sérum physiologique et mise en émulsion avec 200 microlitres d’adjuvant complet <strong>de</strong> Freund<br />
(SIGMA)<br />
Toutes les 2 semaines, les animaux ont subi un rappel vaccinal par injection intra-péritonéale <strong>de</strong><br />
20 microgrammes d’antigène P24 diluée dans 200 microlitres <strong>de</strong> sérum physiologique et mise en<br />
émulsion avec 200 microlitres d’adjuvant incomplet <strong>de</strong> Freund (SIGMA).<br />
7) Dosage <strong>de</strong>s anticorps spécifiques <strong>de</strong> l’antigène P24<br />
La présence d’anticorps spécifiques <strong>de</strong> l’antigène P24 a été recherchée par ELISA 2 semaines,<br />
puis 4 semaines après <strong>la</strong> <strong>de</strong>uxième injection <strong>de</strong> l’antigène suivant <strong>la</strong> technique suivante :<br />
- coating <strong>de</strong> p<strong>la</strong>ques 96 puits (Maxisorb, NUNC) par incubation une nuit à 4° avec <strong>de</strong><br />
l’antigène P24 à <strong>la</strong> concentration <strong>de</strong> 1 microgrammes/ml en tampon Carbonate 0,1 M pH<br />
8,3 (100 microlitres/puits)<br />
- 3 <strong>la</strong>vages en PBS Tween 0,1%<br />
- saturation <strong>de</strong>s p<strong>la</strong>ques en milieu complet {PBS, 3% BSA}(100 microlitres/puits)<br />
- 3 <strong>la</strong>vages en PBS Tween 0,1%<br />
- distribution <strong>de</strong>s sérums à tester dilés au 1/100 ème et au 1/200 ème en tampon {PBS, 1%<br />
BSA}(100 microlitres/puits)<br />
- incubation 3 heures à 37°C<br />
- 3 <strong>la</strong>vages en PBS Tween 0,1%<br />
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