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3) Détection du locus IgH recombiné portant le gène Cγ1 humain (allèle gamma 1 knock-in ou γ1KI) et du locus IgH sauvage (allèle µ sauvage) par PCR L’ADN génomique d’un échantillon de queue d’animaux homozygotes obtenus comme précisé ci-dessus, a été analysé par PCR à l’aide des deux couples d’amorces suivants : - couple spécifique du locus IgH murin non muté (allèle µ sauvage) : - amorce UpstreamSpe I Smu : 5’ GAG TAC CGT TGT CTG GGT CAC 3’ - amorce SacI-3’Imu : 5’ GAG CTC TAT GAT TAT TGG TTA AC 3’ La réaction d’amplification a été réalisée avec une température d’hybridation de 61°C. Cette PCR amplifie en 30 cycles un fragment de 91 paires de bases-encadrant le site Spe I-spécifique du locus IgH murin non muté. gamma1 knock-in ou γ1KI ) : - couple spécifique du locus IgH recombiné portant le gène Cγ1 humain (allèle - amorce NeoI : 5’ GCA TGA TCT GGA CGA AGA GCA T 3’ - amorce Neo2 : 5’ TCC CCT CAG AAG AAC TCG TCA A 3’ La réaction d’amplification a été réalisée avec une température d’hybridation de 55°C. Cette PCR amplifie en 30 cycles un fragment de 120 paires de bases spécifique du locus IgH recombiné portant le gène Cγ1 humain. Une lignée de souris homozygotes pour la mutation γ1KI, dénommée ci-après lignée gamma 1 knock-in ou gammaprim a été établie ; les animaux de cette lignée sont systématiquement et simultanément négatifs en PCR avec les amorces spécifiques de l’allèle µ sauvage et positifs en PCR avec les amorce spécifiques de l’allèle gamma 1 knock-in. 122 Figure 3: Southern Blot sur ADN génomique de queue de souris WT (piste A) hétérozygote γ1-KI (piste B) homozygote γ1-KI (piste C) homozygote γ1-KI floxé (piste D)
4) Dosage du taux des IgG1 sériques totales en néphélométrie et en ELISA Les IgG1 humaines sériques ont été dosées par néphélométrie sur un automate BNII de la société Behring en utilisant le kit Behring IgG1 selon les recommandations du fournisseur. Ces résultats ont été confirmés en ELISA suivant la technique suivante : - coating de plaques 96 puits (Maxisorb, NUNC) par incubation une nuit à 4° avec un anticorps non marqué anti-IgG humaine (monoclonal anti-human IgG, Sigma) dilué au 1/1000 ème en tampon Carbonate 0,1 M pH 8,3 (100 microlitres/puits) - 3 lavages en PBS Tween 0,1% - saturation des plaques en milieu complet {PBS, 3% BSA}(100 microlitres/puits) - 3 lavages en PBS Tween 0,1% - distribution des sérums à tester dilués au 1/100 ème et au 1/1000 ème en tampon {PBS, 1% BSA}(100 microlitres/puits) - incubation 3 heures à 37°C - 3 lavages en PBS Tween 0,1% - distribution d’un antisérum anti-IgG humaines marqué à la phosphatase alcaline (monoclonal anti-human IgG-AP, SIGMA) dilué au 1/1000 ème (100 microlitres/puits) - 3 lavages en PBS Tween 0,1% - réaction enzymatique de révélation par addition de PNP en tampon TRIS 0,2M (Sigma) - blocage de la réaction par addition de soude 3N (30 microlitres/puits) - lecture en spectrométrie à une longueur d’onde d’absortion de 405 nm. 5) Recherche de l’expression d’un récepteur membranaire de la classe des IgG humaines à la surface des lymphocytes périphériques des animaux mutants Préparation des cellules lymphoïdes : La rate, organe lymphoïde secondaire, a été choisie pour cet expérimentation. Cet organe a été prélevé chez différents animaux mutants homozygotes γ1KI puis dilacéré en tampon VERSENE (Invitrogen), et filtré sur tamis (40 microns) afin d’obtenir une suspension de cellules individuelles débarrassée des agégats cellulaires. Les cellules spléniques ont alors été centrifugées et soumises à une étape supplémentaire de choc osmotique afin d’obtenir la lyse des globules rouges par reprise du culot cellulaire dans 1 ml d’eau distillée. Les cellules ont ensuite été immédiatement reprises en milieu complet (RPMI + 10% sérum de veau fœtal), numérées et conservées sur glace. 123
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de m’avoir donnée le goût pour
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1.2.2 Le Locus Igλ Les gènes de c
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La commutation isotypique, permetta
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L’action des cytokines semble s
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Sato, M., Adachi, T. and Tsubata, T
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