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15 Esami di biologia molecolare 15 Esami di biologia molecolare 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Adenovirus equino 1 (DNA) Anaplasma spp. (DNA, rilevazione di più specie) Arterite Virale Equina (EVA, Equine Viral Arteritis) (RNA) tampone corneale, congiuntivale PCR (1) cfr. → capitolo 13, Malattie infettive 2 ml EB, milza, midollo real time-PCR (1) In animali con sintomi clinici un esito positivo è a favore di un'infezione con uno o più dei seguenti agenti eziologici: A. phagocytophylum, A. platys. È possibile richiedere una differenziazione tra A. phagocytophylum e A. platys ricorrerendo ad un'analisi sequenziale del prodotto PCR amplificato. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Materiale a seconda della sintomatologia real time-PCR (1) (vedi sotto) Esistono diversi tipi di materiale indicati per un'analisi di genetica molecolare dell'EVA: - sperma, liquido seminale (1 ml) - tampone vaginale, lavaggio vaginale (2-5 ml) - secreto nasale, lavaggio tracheale (2-5 ml) - S, EP, CP (1 ml) - EB, NaF (3 ml) - tessuto: linfonodale, splenico, (almeno 0,5 g) polmonare, placentale, fetale - (urina) (5 ml) cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Attenzione In Italia l'arterite virale equina è una malattia soggetta a obbligo di denuncia. Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Babesia felis (DNA) (gatto) Babesia spp. (DNA) (cane) Babesia spp. (DNA) (cavallo) 0,5 ml EB real time-PCR (1) La microscopia rappresenta ancora l'esame diagnostico standard per rilevare una babesiosi. La PCR mostra tuttavia notevoli vantaggi in termini di sensibilità. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive 0,5 ml EB real time-PCR (1) Il test permette di rilevare Babesie sia grandi che piccole; l'esame comprende un'analisi sequenziale, in grado di differenziare tra: B. canis canis, B. canis vogeli, B. canis rossi, B. gibsonii e B. conradae. Rispetto all'identificazione con il microscopio ottico su striscio di sangue la PCR è nettamente più sensibile.La parassitemia inizia 5-10 giorni dopo l'infezione. In caso di infezione cronica le fasi parassitemiche si alternano a momenti di quiescenza e scomparsa dal circolo periferico del parassita, rendendo spesso difficile il rilievo diretto del parassita. Una rilevazione diretta del parassita non è quindi sempre possibile! 0,5 ml EB PCR (1) Dal punto di vista sierologico un'infezione con Babesia spp. è rilevabile a partire da almeno 10-14 gg. p.i. In rari casi la sieroconversione può mancare del tutto. Nella fase iniziale dell'infezione è possibile rilevare l'agente patogeno al microscopio su striscio di sangue. Tuttavia, dal momento che spesso è solo una piccola percentuale degli eritrociti ad essere colpita, si possono avere dei risultati erroneamente negativi. La PCR è un metodo alternativo sensibile per ottenere chiarezza diagnostica in merito a un'infezione con Babesia anche prima della formazione di anticorpi specifici. È anche possibile, qualora sussista un particolare interesse, una differenziazione delle singole specie per mezzo di analisi sequenziale della PCR amplificato. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive 232 233
15 Esami di biologia molecolare 15 Esami di biologia molecolare 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Bartonella spp. (DNA) 0,5 ml EB, puntato linfonodale, real time-PCR (1) tampone congiuntivale cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Borna (RNA) 1 ml liquor, retina PCR (3) (inviare un bulbo intatto) Borrelia burgdorferi sensu lato(DNA) cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Zoppia: biopsia articolare PCR (1) Sintomi del sistema nervoso centrale: 0,5 ml liquor Altro: zecca Data l'elevata sieroprevalenza all'interno della popolazione canina, l'interpretazione dei risultati dei test sierologici è spesso problematica. Solo una crescita significativa del titolo o un titolo iniziale molto alto sono suggestivi di un'infezione acuta.In presenza di sintomi clinici la rilevazione dell'agente patogeno per mezzo di PCR costituisce un mezzo veloce - e molto informativo in caso di risultato positivo - per confermare un sospetto clinico. Un risultato negativo della PCR tuttavia non è sufficiente per escludere una borreliosi, dal momento che l'agente patogeno potrebbe essere localizzato altrove nell'organismo. È perciò necessaria una scelta critica del materiale di analisi!Nei cavalli provenienti da zone endemiche si hanno titoli anticorpali anti-B. burgdoferi, ma la rilevanza clinica dell'infezione è tuttavia oggetto di discussione. Sono state descritte zoppie, poliartrite e panuveite in connessione con l'infezione da Borrelie nel cavallo, una rilevazione dell'agente patogeno per mezzo di PCR sugli organi coinvolti è in linea di principio possibile. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Calicivirus (RNA) (gatto) Tampone: nasale, faringeo, oculare real time-PCR (1) Malattia acuta: 1 ml EB cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Chlamydophila spp. (DNA) Chlamydophila felis (DNA) Congiuntivite: tampone congiuntivale real time-PCR (1) Sintomi delle vie respiratorie: tampone nasale, faringeo Aborto: tampone vaginale I risultati più significativi si ottengono prelevando il campione fin dalla prima comparsa dei sintomi. Dal momento che le Clamidie sono batteri intracellulari obbligati, occorre fare attenzione a ottenere campioni su tampone il più possibile ricchi di cellule. Un risultato positivo della PCR conferma il coinvolgimento delle Clamidie nel quadro clinico osservato, un risultato negativo invece non è sufficiente per escluderne il coinvolgimento. La PCR effettuata sulla regione genomica 16S rRNA per la rilevazione di quella che finora era chiamata Chlamydia psittaci non permette di differenziare fra loro Chlamydophila psittaci, Chl. abortus, Chl. felis e Chl. caviae. Per una differenziazione delle specie di Chlamydophila sopra elencate si può tuttavia anche prendere in considerazione l'adattamento delle singole specie ai loro animali ospiti: perciò si troverà Chlamydophila psittaci negli uccelli, Chl. abortus soprattutto negli ovini, Chl. felis nei gatti e Chl. caviae nelle cavie. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Congiuntivite: tampone congiuntivale real time-PCR (1) Sintomi delle vie respiratorie: tampone nasale o faringeo Aborto: tampone vaginale La clamidiosi felina (polmonite felina) viene sostenuta dal batterio Chlamydophila felis. La clamidiosi è frequente e diffusa in tutto il mondo. Chl. felis è responsabile principalmente di una congiuntivite follicolare cronica con scolo oculare che può anche essere purulento. Questa forma oculare si presenta soprattutto in gattini tra le 5 e le 12 settimane d'età. Un'infiammazione polmonare è invece rara. Una real time-PCR sul gene ompA di Chl. felis permette di differenziarla specificamente da altre specie di Chlamydopila. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive 234 235
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