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15 Esami di biologia molecolare 15 Esami di biologia molecolare 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Helicobacter spp. (DNA, rilevazione di più specie) Herpesvirus canino 1 - CHV 1 (DNA) feci, biopsia gastrica PCR (1) Sul significato patogeno di un'infezione da Helicobacter negli animali disponiamo al momento di risultati in parte contraddittori. Nel cane e nel gatto con gastrite, vomito cronico o enterite è possibile infatti isolare delle specie di Helicobacter dalla mucosa gastrica. Una tale rilevazione è d'altronde possibile anche in animali sani e ci sono buone ragioni per ritenere che il tasso di infezione nella popolazione dei cani e dei gatti si aggiri fra il 40 e il 100%. Una risultato positivo alla rilevazione del DNA di Helicobacter nei roditori (cavie da laboratorio) può essere differenziato ulteriormente distinguendo fra H. bilis, H. hepaticus e H. muridarium (richiesta di analisi da fare separatamente). cfr. anche → capitolo 13, Malattie infettive Mortalità improvvisa fra i cuccioli: PCR (1) tessuto epatico, polmonare, renale e splenico Infezioni genitali: tampone vaginale Aborti: materiale abortivo Sintomi delle vie respiratorie: tampone nasale e faringeo cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Herpesvirus equino 1 EHV-1 (DNA) Herpesvirus equino 4 EHV-4 (DNA) Sintomi delle vie respiratorie: PCR (1) tampone nasale/faringeo/ secreto tracheale Malattia acuta/febbre: 1 ml S, HP, EP PCR (1) Congiuntivite: tampone congiuntivale Aborto: liquido amniotico, endometrio, feto Sintomi del sistema nervoso centrale: 0,5 ml liquor Nel caso delle infezioni da Herpesvirus la valutazione di risultati dei test sierologici è spesso particolarmente difficile per diversi motivi: 1. A causa della persistenza virale propria degli Herpesvirus, dopo una prima infezione è sempre possibile che, in condizioni di stress, si abbia una riattivazione del virus e conseguente stimolazione della produzione di anticorpi. 2. Dal momento che gli anticorpi del siero non portano ad un'immunità permanente, si possono avere delle reinfezioni anche con un titolo anticorpale elevato. 3. Specialmente nelle forme respiratorie della malattia la produzione di anticorpi può essere insufficiente. In generale è l'immunità cellulare a svolgere il ruolo principale nella difesa immunitaria contro l'EHV, l'immunità umorale ha un ruolo subordinato. La diagnostica con metodo PCR ha il vantaggio di assicurare, grazie all'identificazione dell'agente patogeno direttamente sull'organo interessato, il nesso eziologico fra malattia acuta e infezione da Herpesvirus. Soprattutto in caso di aborto l'analisi del liquido amniotico e della mucosa uterina è il metodo di scelta. È possibile peraltro che i feti abortiti si rivelino negativi al virus anche in aborti dovuti a EHV (aborto dovuto a scarsa alimentazione del feto attraverso la placenta)! Un risultato positivo alla PCR sulle componenti cellulari del sangue non è una prova sufficiente di un coinvolgimento degli Herpesvirus nella malattia acuta, in quanto i virus possono persistere nei leucociti anche in seguito ad un'infezione precedente. La differenziazione tra EHV-1 ed EHV-4 è un procedimento di routine nel protocollo del test. 244 245
15 Esami di biologia molecolare 15 Esami di biologia molecolare 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Herpesvirus equino 2 EHV-2 (DNA) Herpesvirus equino 5 EHV-5 (DNA) Herpesvirus felino 1 FHV 1 (DNA) Herpesvirus rettili - RHV (DNA) Influenza virale equina (RNA) Sintomi oculari: PCR (1) tampone corneale o congiuntivale Sintomi delle vie respiratorie: tampone nasale, secreto nasale o tracheale Anche in questo caso la PCR ha il vantaggio di identificare un nesso eziologico fra agente patogeno ed organo bersaglio. Tampone cfr. → EHV 2 PCR (1) La rilevazione specifica di EHV-5 con metodo PCR è possibile, la sua rilevanza clinica tuttavia non è ancora chiarita. Cheratocongiuntivite: real time-PCR (1) tampone dalla regione lesa della cornea/congiuntiva Rinotracheite: tampone nasale o faringeo Infezioni genitali: tampone vaginale Aborto: materiale abortivo Mentre gli animali con malattia acuta rilasciano grandi quantità di virus, l'escrezione dell'agente patogeno dagli animali con infezione cronica è modesta e intermittente. Grazie alla sua elevata sensibilità, la PCR offre un buon metodo di analisi per l'identificazione di questi escretori cronici del virus. Tuttavia, data la discontinuità dell'escrezione, in caso di risultato negativo è necessario ripetere il test. Tampone buccale in soluzione fisiologica PCR (3) La PCR permette la ricerca diretta dell'agente patogeno. cfr. anche → capitolo 13, Malattie infettive Tampone nasale, lavaggio tracheale real time-PCR (1) cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Leishmania spp. (DNA, rilevazione di più specie) Leptospira spp. (DNA, rilevazione di più specie) Particolarmente efficace è la PCR su puntato linfonodale e di midollo osseo. Uno dei vantaggi più notevoli della rilevazione dell'agente patogeno con metodo PCR consiste nella possibilità di identificare animali portatori sani, nei quali i titoli anticorpali spesso restano al di sotto della soglia di rilevabilità.La rilevazione dell'agente patogeno con metodo PCR su midollo osseo può anche essere impiegata a fini di controllo terapeutico. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive La rilevazione dell'agente patogeno con metodo PCR viene effettuata su sangue nelle prime 2 settimane (eventualmente fino a due mesi) dopo l'infezione, ma a partire dalla seconda settimana p.i. si deve tuttavia privilegiare l'urina come materiale di analisi. Le Leptospire restano infatti rilevabili nell'urina per mesi, se non per anni, sebbene vengano rilasciate con ritmo intermittente. Rispetto ai metodi sierologici la PCR ha così il vantaggio di poter confermare un sospetto clinico già nelle primissime fasi dell'infezione, prima ancora della comparsa di anticorpi specifici (ca. 10 giorni p.i.). Permette inoltre di identificare escretori cronici, anche se vaccinati. Tuttavia, a causa del rilascio intermittente, in caso di risultato negativo è necessario ripetere il test. cfr. anche → capitolo 13, Malattie infettive Attenzione La leptospirosi è una zoonosi.In Italia la leptospirosi è una malattia soggetta a obbligo di denuncia. Leucemia felina Lesioni cutanee: biopsia cutanea real time-PCR (1) Linfoadenopatia: puntato linfonodale Rinite: tampone nasale Inoltre: biopsia osteo-midollare, epatica, splenica 2 ml EB, 5 ml U, liquor, umore acqueo real time-PCR (1) vedi → FeLV 246 247
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