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15 Esami di biologia molecolare 15 Esami di biologia molecolare 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Chlamydophila psittaci (DNA) Gli uccelli infettati con Chlamydophila psittaci possono restare a lungo asintomatici o mostrare sintomi non specifici. Talvolta si assiste solo a distanza di anni all'insorgere di una clamidiosi. L'eliminazione dell'agente patogeno nelle feci inizia circa 3 giorni p.i., ma può durare per mesi ed è spesso intermittente. Animali con una forma latente possono, in condizioni di immunodeppressione (stress, malattia), diventare nuovamente escretori dell'agente patogeno. La quantità di batteri così eliminati e la frequenza dell'eliminazione aumentano negli animali stressati o ammalati. Il tampone cloacale è il mezzo di identificazione più idoneo per l'identificazione di uccelli infetti, in particolare di portatori cronici, che rappresentano il principale pericolo di infezione per altri uccelli, oltre che una fonte di infezione per l'uomo (zoonosi!). Dato il ritmo intermittente con cui viene rilasciato l'agente patogeno, in caso di sospetto clinico e contemporaneo risultato negativo della PCR, il test deve essere ripetuto. Grazie al metodo della "real time-PCR", da poco introdotto nei nostri laboratori (consigliato dall'Istituto Friedrich Löffler, Centro di Riferimento Nazionale per la psittacosi) (NdC, assimilabile agli Istituti Zooprofilattici italiani) è oggi possibile la rilevazione specifica di Chlamydophila psittaci, differenziandola da altre specie di Chlamydophila. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Attenzione In Italia la psittacosi è una malattia soggetta a obbligo di denuncia, mentre le altre infezioni da Chlamydophila sono soggette a obbligo di segnalazione. CHV 1 tampone cloacale, feci real time-PCR (1) tampone congiuntivale vedi → Herpesvirus canino Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Cimurro canino (CDV) (RNA) Congiuntivite: tampone congiuntivale real time-PCR (1) Fase febbrile: 2 ml EB Sintomi del sistema nervoso centrale: 0,5 ml liquor Gastroenterite: tampone rettale Sintomi delle vie respiratorie: secreto nasale Il virus del cimurro canino (CDV, Canine Distemper Virus) si moltiplica a partire dall'8° giorno p.i. nelle cellule epiteliali di diversi organi (vie respiratorie, tratto digerente, tratto urogenitale, cute) e nel sistema nervoso centrale; è il luogo di replicazione del virus a determinare la sintomatologia clinica. A partire da questo momento è possibile rilevare il virus negli organi infettati con metodo PCR. Ad eccezione delle forme con decorso cronico, l'escrezione del virus termina con la scomparsa dei sintomi clinici. Dopodiché il virus non è più rilevabile. Contrariamente a quanto succede per la rilevazione degli anticorpi, l'alta percentuale di animali vaccinati non rappresenta un problema decisivo per la diagnosi con PCR, in quanto il virus vaccinale è rilevabile solo fra gli 8 e i 21 giorni al massimo post vaccinazione e resta confinato al tessuto linfatico. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive 236 237
15 Esami di biologia molecolare 15 Esami di biologia molecolare 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) 15.2 Rilevazione di agenti patogeni con metodo PCR (in ordine alfabetico) Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Circovirus suino 2 (PVC-2) (DNA) Coronavirus canino CECoV (RNA) Coronavirus felino/FIP, FECV Linfonodi, polmone, fegato, milza, PCR (3) eventualmente tampone nasale Il Circovirus suino di tipo 2 (PVC-2) è stato descritto da non molto tempo (Canada 1998) a differenza del PCV-1, che è invece un Circovirus già noto da tempo e non patogeno. Il PVC-2 provoca i sintomi più svariati nei maiali da ingrasso o in fase di svezzamento (p.es. rallentamento della crescita, dispnea, ingrossamento dei linfonodi, pallore, ittero, diarrea), il cui complesso è anche conosciuto come "sindrome deperimento multisistemico post svezzamento" (PMWS, Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome). Un quadro clinico manifesto è stato finora riscontrato solo in combinazione con infezioni secondarie (PRRS, Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, sindrome respiratoria e riproduttiva del suino e PPV, Porcine Parvovirus, Parvovirus suino). Un'altra sindrome a cui viene collegato il Circovirus suino 2 è la "sindrome dermatite e nefropatia del suino" (PDNS, Porcine Dermatitis Nephropathy Syndrome). Si tratta probabilmente di una patologia da immunocomplessi, sulla quale peraltro ancora non si conosce molto. Anche sull'escrezione del virus si dispone di poche informazioni: è stato rilevato finora sperimentalmente nel secreto oculare, nella saliva e nelle feci. La trasmissione transplacentare, anche se possibile, non svolge probabilmente un ruolo importante. Il virus mostra un'affinità per il tessuto linfatico e porta ad un'immunodepressione, che è causa a sua volta di infezioni secondarie. Problemi di gestione dell'allevamento possono favorire l'insorgere della sindrome. La mortalità può superare l'80%. Si possono avere infezioni latenti. tampone rettale, feci real time-PCR (1) cfr. → capitolo 13, Malattie infettive vedi → FIP/Coronavirus felino, FECV Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Coronavirus TGEV (Gastroenterite trasmissibile del suino) (RNA) cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Attenzione In Italia la gastroenterite trasmissibile (TGE, Transmissible Gastro Enteritis) è una malattia soggetta a obbligo di denuncia. Dirofilaria Ehrlichia spp. (DNA, rilevazione di più specie) (cane, gatto) feci, tampone rettale, mucosa intestinale real time-PCR (1) vedi → Filaria spp. 2 ml EB, 0,5 ml liquor real time-PCR (1) In animali con sintomi clinici un esito positivo è a favore di un'infezione con uno o più dei seguenti agenti eziologici: E. canis, E. ewingii, E. chaffeensis. È possibile richiedere una differenziazione delle singole specie ricorrerendo ad un'analisi sequenziale del prodotto PCR amplificato. cfr. → capitolo 13, Malattie infettive Ehrlichia canis (DNA) 2 ml EB, biopsia splenica, midollo osseo real time-PCR (1) Con metodo PCR è possibile rilevare E. canis nel sangue già a partire dal 4° giorno p.i., vale a dire ben prima della comparsa dei primi anticorpi. Con questo metodo è anche possibile controllare la riduzione dell'agente patogeno sotto la soglia di rilevabilità in seguito a terapia antibiotica, mentre a causa della lunga persistenza degli anticorpi la sierologia è meno adatta ad un controllo terapeutico. Un risultato positivo alla PCR conferma il sospetto di un'infezione da E. canis, un risultato negativo invece non è sufficiente a escludere un'ehrlichiosi, essendo possibile che al momento del prelievo le Ehrlichie non si trovassero nel sangue, o che non lo fossero in misura sufficiente, o che fosse in corso un'infezione con altre specie di Ehrlichia. 238 239
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