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15 Esami di biologia molecolare 15.4 Determinazione del sesso negli uccelli Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni Categoria Genotipo Classificazione dei genotipi secondo il National Scrapie Plan (NSP) britannico: NSP5 VRQ/VRQ, ARQ/VRQ, ARH/VRQ, VRQ/AHQ Molto suscettibile alla Scrapie NSP4 ARR/VRQ Suscettibile alla Scrapie NSP3 AHQ/AHQ, AHQ/ARH, AHQ/ARQ, ARH/ARH, ARH/ARQ, ARQ/ARQ Poco resistente alla Scrapie NSP2 ARR/AHQ, ARR/ARH, ARR/ARQ Resistente alla Scrapie NSP1 ARR/ARR Molto resistente alla Scrapie Metodo del test Sequenziazione diretta del DNA. È considerato il metodo più affidabile, in grado di riconoscere con sicurezza tutte le mutazioni note e anche quelle nuove. Test genetico possibile con tutte le razze ovine 280 15.5 Test genetico di paternità Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni n Nozioni generali Per la determinazione del sesso negli uccelli si ricava DNA dalla polpa della penna, dal sangue EDTA o dal guscio (membrana) dell'uovo. Si amplifica quindi una regione specifica del DNA con metodo PCR e si rileva nella sequenza genica dei cromosomi sessuali il polimorfismo specifico del sesso con due metodi, in parte distinti, di biologia molecolare. Si può così determinare il sesso in parecchie centinaia di specie aviarie (una lista delle specie è disponibile su richiesta nel nostro laboratorio). Per quanto riguarda gli uccelli corridori, una determinazione del sesso con questo metodo è possibile per il casuario, ma non per emù, struzzo, nandù e kiwi. Determinazione del sesso negli uccelli EB, penne, guscio (membrana dell'uovo) PCR (1) EB 2-3 gocce sono già sufficienti. 15 Esami di biologia molecolare Penne Spedire una grossa penna o più penne piccole con calamo intatto. Le penne in crescita contengono molto più DNA delle penne già formate e sono perciò particolarmente adatte alla determinazione del sesso. Si possono tuttavia impiegare anche penne già formate o cadute da poco. L'appartenenza della penna ad un determinato individuo deve essere assicurata in modo univoco e si deve escludere ogni possibile contaminazione con materiale genetico estraneo (p.es. polvere della voliera, sabbia della gabbia). Se le penne fossero insanguinate, si prega di inviarle in una provetta sterile, eventualmente accorciandone l'estremità superiore. In caso di penne asciutte è possibile inviarle in un sacchetto di plastica ermeticamente chiuso. Guscio dell'uovo È possibile isolare il DNA dalla membrana dell'uovo, il guscio deve essere perciò il più possibile intatto. Ancora più indicata è una goccia di sangue ombelicale prelevata dal guscio con un tampone sterile. Si presti particolare attenzione all'attribuzione del guscio a ciascun rispettivo individuo. Attenzione - Il materiale di analisi va protetto da ogni contaminazione con polpa o sangue estraneo, o qualsiasi altro materiale contenente DNA, per evitare risultati dubbi o erronei. - Il materiale di analisi (sangue, polpa) può venire conservato a temperatura di frigorifero per parecchi giorni. - Se asciutte, le penne possono venire conservate a temperatura ambiente per più settimane. - I campioni di analisi vanno contrassegnati indicando la specie esatta (se possibile, con nome scientifico), il numero dell'anello di identificazione e la data del prelievo. Potete richiederci l'apposito modulo di richiesta o scaricarlo direttamente da www.idexx.it. 281
15 Esami di biologia molecolare 15.5 Test genetico di paternità Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni n Nozioni generali Un test genetico di paternità ha la funzione di chiarire se i genitori presunti di un animale sono i suoi genitori biologici. Il test di paternità con metodi di biologia molecolare viene effettuato ricorrendo all'analisi dei microsatelliti. Principio del test Il patrimonio genetico contiene un gran numero di segmenti di DNA, detti microsatelliti, composti da porzioni di DNA che si ripetono più volte. Il numero di tali ripetizioni, vale a dire la lunghezza del microsatellite, varia da individuo a individuo. Si ritiene che il genoma umano contenga circa 100.000 di tali loci genici microsatellitari. In questo modo ogni individuo possiede un proprio genoma inconfondibile, che non è comune a nessun altro individuo (ad eccezione dei gemelli monovulari). Un individuo eredita 50% del suo patrimonio genetico dalla madre e 50% dal padre. Questo significa che tutte le variazioni del genoma, come p.es. quelle contenute nelle sequenze microsatellitari ad alta variabilità, se non provengono dalla madre, devono essere state ereditate dal padre. Se nel patrimonio genetico di un individuo con madre nota si rilevano, per mezzo dell'analisi dei microsatelliti, almeno due sequenze che non compaiono né nel genoma della madre né in quello del presunto padre, allora si può escludere la paternità con assoluta sicurezza. Confrontando più di un locus genico microsatellitare la sicurezza della rilevazione aumenta. Per questo motivo si analizzano nel cavallo 17 microsatelliti, nel gatto 10 e nel cane 9, secondo le indicazioni dell'ISAG (International Society for Animal Genetics). Test di paternità 2 ml EB PCR (3) 282 Per il test di paternità ci occorrono un campione dell'individuo discendente e uno di ciascun genitore presunto. Si faccia attenzione a contrassegnare chiaramente i campioni di analisi. Esempio: in caso di madre nota e di due animali da prendere in considerazione come padri presunti, siete pregati di inviarci materiale di analisi tratto da: 1. figlio in esame 2. madre 3. padre presunto A 4. padre presunto B Potete richiederci l'apposito modulo di richiesta o scaricarlo direttamente da www.idexx.it. 15.5 Test genetico di paternità Nome del test Quantità/Materiale Metodo Osservazioni DNA-Fingerprinting- Identificazione genetica Test possibile con cavallo, cane, gatto 15 Esami di biologia molecolare 0,5 ml EB PCR (3) La "impronta digitale genetica" (DNA-Fingerprinting) è l'unica prova inalterabile e non soggetta a contraffazioni dell'identità di un individuo, molto più affidabile dell'identificazione del microchip innestato o del tatuaggio. Il test sfrutta l'elevata variabilità individuale del materiale genetico e permette un'identificazione sopra ogni dubbio anche dopo la morte del soggetto.I risultati della "impronta digitale genetica" vengono salvati su supporto elettronico nei nostri laboratori e possono essere forniti su richiesta in ogni momento (in caso di perdita o furto di un animale, danni a oggetti causati da animali ecc.). Il proprietario riceve un certificato contenente il profilo del DNA del suo animale. Ogni individuo possiede il suo genoma inconfondibile (ad eccezione dei gemelli monovulari), così, sulla scorta del profilo del DNA di due campioni di materiale inviati, è possibile affermare senz'ombra di dubbio se essi appartengano o no allo stesso animale (test di "Identificazione genetica"). Il test di identificazione genetica è il metodo di scelta per questioni di natura forense (danni a cose, furto di animali ecc.). Analisi di sequenza PCR (1) Per analisi di sequenza del DNA nella biologia molecolare e nella bioinformatica si intende un procedimento automatizzato e computerizzato di determinazione di porzioni caratteristiche, in particolare di geni, in un filamento di DNA. Oggetto dell'analisi sono le informazioni ottenute per mezzo della sequenziazione del DNA sulla successione e sulla posizione delle coppie di basi. Attraverso ricerche di omologia con le informazioni raccolte nelle banche dati internazionali di sequenze è possibile fare quindi delle asserzioni p.es. sul tipo di organismo dal quale sono stati isolati gli acidi nucleici o su anomalie (mutazioni) nella sequenza di acidi nucleici rispetto ad una sequenza standard. Questo metodo viene impiegato nello studio di molte malattie ereditarie, ma può essere anche utilizzato in casi particolari per caratterizzare e differenziare più esattamente prodotti della PCR ottenuti con procedimenti di analisi estesi a più specie. Tale differenziazione secondo la specie può essere effettuata solo previo accordo con il laboratorio. 283
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4 Ematologia 4.4 Parassiti del sang
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8 Malattie renali e delle vie urina
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