verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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Voraussetzungen. Daher wurde das Primerpaar, das zur Detektion der Exon 1a-Isoform diente,
auch zur Detektion der Exon 1b-Isoform genutzt. Somit wurden die Exon 1a- und
Exon 1b-Isoform gleichzeitig in einem PCR-Ansatz nachgewiesen. Die Unterscheidung dieser
beiden Isoformen erfolgte im Agarosegel durch den Laufunterschied von 27 bp.
Zur Detektion der Exon 1a-Form bzw. Exon 1b-Isoform wurden zwei Primerpaare
konstruiert (1. Primerpaar: La-mRNA-F1 und La-mRNA-R1; 2. Primerpaar: La-mRNA-F2 und
La-mRNA-R1), um die Nachweischancen zu erhöhen, da mit beiden Primerpaaren bei
veschiedenen Geweben bzw. Zellkulturen die Effizienz der cDNA-Amplifikation unterschiedlich
war. Die mit dem 1. Primerpaar La-mRNA-F1 und La-mRNA-R1 (3.20) amplifizierte
Exon 1a-Form besaß eine Größe von 376 bp, die Exon 1b-Form eine Größe von 398 bp. Die
mit dem 2. Primerpaar La-mRNA-F2 und La-mRNA-R1 (3.20) amplifizierte Exon 1a-Form
besaß eine Größe von 349 bp, die Exon 1b-Form eine Größe von 371 bp.
Wenn im Agarosegel zwei Banden detektiert werden konnten, so bedeutete dies, dass
sowohl die Exon 1a- als auch die Exon 1b-Isoform exprimiert wurden. War auf dem Agarosegel
dagegen nur eine Bande zu erkennen, so musste festgestellt werden, um welche Isoform es
sich dabei handelte. Dazu wurde die cDNA aus dem Agarosegel eluiert (4.12), durch
T/A-Klonierung (4.14.2) in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-T (3.10) einkloniert und mit den
Standard-Primern T7, SP6 und/oder T3 (3.20) sequenziert (4.17).
Mit den beiden Primern La-mRNA-F3 und La-mRNA-R1 (3.20) wurde die
Exon 1c-Isoform in einem eigenen PCR-Ansatz amplifiziert. Die mit dieser Primerkombination
amplifizierte cDNA besaß eine Größe von 362 bp.
Um festzustellen, ob die PCR unter den gewählten Bedingungen erfolgreich sein konnte
und um eine Degradation der total-RNA auszuschließen, wurden für jedes Gewebe bzw.
Zellkulturen als Positiv-Kontrollen PCR-Fragmente mit zwei unterschiedlichen Primerpaaren
amplifiziert. Zum einen wurde mit den Primern GAPDH-Vor und GAPDH-Rück (3.20) ein
Bereich der Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) amplifiziert. Dieses
PCR-Fragment besaß eine Größe von ca. 500 bp und sollte immer in allen Geweben bzw.
Zellkulturen detektierbar sein, da es sich bei der GAPDH um ein essentielles, permanent
exprimiertes Haushaltsgen handelte, das eine wichtige Funktion in der Glycolyse ausübte.
Außerdem wurde mit den Primern La-Murin-RT-PCR-Vor und La-Murin-RT-PCR-Rück
(3.20) ein PCR-Fragment von La/SS-B amplifiziert, das nur den codierenden Leserahmen
(Exon 2–11) enthielt. Dieses PCR-Fragment besaß eine Größe von 1285 bp. Da mit dieser
Primerkombination keine Isoform-spezifischen PCR-Produkte amplifiziert wurden, konnte mit
dieser RT-PCR festgestellt werden, ob eine generelle La/SS-B-mRNA-Expression stattfand.
Die Agarosegele zur Analyse der PCR-Fragmente aus verschiedenen Mausgeweben
und Mausembryonen sind in Abb. 8 dargestellt. In Abb. 9 finden sich die Agarosegele zur
Analyse der PCR-Fragmente aus murinen Zellkulturen und Primärzellen mit einer Konfluenz
von >80% bzw.