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20 2 Aufgabenstellung Auf Proteinebene stellen sich konkret folgende Fragen: • Wie viel Homologie zeigt das murine La/SS-B-Protein zum humanen. Welche Abweichungen in der AS-Sequenz lassen sich feststellen. Was resultiert daraus für die funktionellen Domänen? • Lassen sich für das murine La/SS-B verschiedene isoelektrische Proteinformen nachweisen? Besitzt das murine La/SS-B-Protein eine hohe Ladungsheterogenität, ebenso wie das humane? Unter pathophysiologischen Bedingen ergeben sich folgende Fragestellungen: • Hat das Molekül Stickstoffmonoxid (NO) Einfluß auf das murine Autoantigen La/SS-B und könnte es dadurch zur Ausbildung von Autoimmunität kommen? Speziell soll das Augenmerk auf eine Veränderung der Proteinexpression und der Proteinlokalisation liegen. • Kann das Neoepitop, das bei der autoimmunen pSS-Patientin auf Grund einer Rasterschubmutation im codierenden Leserahmen des humanen La/SS-B-Gens entsteht, bei Immunisierung von Balb/c-Mäusen zur Erzeugung von anti-Neoepitop-AK führen? Können sich nach der Theorie des intramolekularen epitope spreading des weiteren Autoantikörper gegen das native La/SS-B-Protein nachweisen lassen? Kann die B-Zell-Autoimmunität und die Entstehung von ANAs somit auf einen Autoantigen-getriebenen Mechanismus infolge einer fehlerhaften Proteinexpression zurückgeführt werden? • Wenn sich Autoantikörper induzieren lassen, sind diese dann für eine zellschädigende Vorläuferreaktion verantwortlich, durch die die nukleären Autoantigene dem Immunsystem zugänglich gemacht werden?
3 Materialien 21 3 MATERIALIEN 3.1 Chemikalien und ihre Abkürzungen Alle Salze, Säuren, Basen und Lösungsmittel (auch hier nicht explizit aufgeführte Substanzen) besaßen p.a. Qualität oder wurden in ihrer konzentriertesten oder reinsten Form bezogen. Substanz 2-Butanol 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure (MOPS) 4-Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galactosid (X-Gal) 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP, X-Phosphat) Aceton Acrylamidlösung Agar-Bacteriological Agarose und Low Melting Agarose (LMP-Agarose) Ammoniumperoxodisulfat (APS) Ampicillin (D[-]-Aminobenzylpenicillin-Na-Salz) Blockierungsreagenz Bovines Serumalbumin (BSA), Fraktion V Bromphenolblau (Na-Salz) Chloroform Coomassie-Brillant-Blau G250 CSPD (Dinatrium 3-(4-methoxy-spiro{1,2-dioxetan-3,2’- (5’-chloro)-tricyclo[3.3.1.1. 3,7 ]decan}-4-yl) phenylphosphat) Diethylpyrocarbonat (DEPC) Dimethylformamid (DMF) Dimethylsulfoxid (DMSO) Dithiothreitol (DTT) Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM-Medium) Entwickler für Röntgenfilme, Kodak LX 24 Essigsäure Ethanol Ethidiumbromid Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure (EDTA) Ethylenglycol-bis-N,N,N’,N’-tetraessigsäure (EGTA) Fixierer für Röntgenfilme, Kodak AL4 Fetales Kälberserum (FKS) Vertreiber/Hersteller Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Sigma Chemical Co., Deisenhofen Sigma Chemical Co., Deisenhofen Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Sigma Chemical Co., Deisenhofen Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Gibco/ BRL GmbH, Eggenstein Biozym, Hameln Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA Sigma Chemical Co., Deisenhofen Roche, Mannheim Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Serva Feinbiochemika, Heidelberg Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Sigma Chemical Co., Deisenhofen Tropix, Bedford, Massachusetts, USA Sigma Chemical Co., Deisenhofen Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Sigma Chemical Co., Deisenhofen Sigma Chemical Co., Deisenhofen Gibco/ BRL GmbH, Eggenstein Kodak AG, Stuttgart Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Carl Roth GmbH und Co., Karlsruhe Sigma Chemical Co., Deisenhofen Sigma Chemical Co., Deisenhofen Sigma Chemical Co., Deisenhofen Kodak AG, Stuttgart Roche, Mannheim
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