verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
4.44 Antikörper-Elution
Nach der Detektion mit dem ECL-System (4.43) konnten AK wieder von der Membran eluiert
werden. Dadurch war es möglich, die Membran mit einem anderen primären und sekundären AK zu
inkubieren. Die zweite Detektion erfolgte immer mit dem NBT-X-Phosphat-(BCIP-) System (4.42). Für die
Elution wurde die Membran 3mal 5 min mit 1x TBST (0,15 M NaCl; 0,01 M Tris/HCl; 1% [v/v] Tween 20;
pH 7,5) gewaschen, anschließend für 10 min mit Elutionspuffer (500 mM NaCl; 200 mM Glycin; pH 2,3)
überschichtet, wieder 3mal 5 min mit 1x TBST gewaschen und nochmals für 10 min mit Elutionspuffer
inkubiert. Die pH-Sprünge führten dabei zum Lösen der Antigen-AK-Bindungen. Zuletzt erfolgte ein
Waschschritt mit 1x TBS (150 mM NaCl; 10 mM Tris/HCl; pH 7,5). Danach wurde, wie unter 4.41
beschrieben, fortgefahren.
4.45 Hochauflösende, zweidimensionale Gelelektrophorese
Die hochauflösende, zweidimensionale Elektrophorese mit immobilisierten pH-Gradienten wurde
nach der Methode von GORG et al. (2000) durchgeführt. Der Stand der Technik wurde regelmäßig von
GORG et al. im lnternet aktualisiert (http://www.weihenstephan.de/blm/deg). Mit der isoelektrischen
Fokussierung (1. Dimension) wurden Proteine auf Grund ihres relativen Gehalts an sauren und basischen
AS nach ihren isoelektrischen Punkten in einem immobilisierten pH-Gradienten (IEF-IPG) aufgetrennt.
Der isoelektroische Punkt (pI) eines Proteins war derjenige pH-Wert, bei dem seine Nettoladung Null
betrug. Bei diesem pH-Wert war die elektrophoretische Beweglichkeit ebenfalls gleich Null. Bei der
Elektrophorese eines Proteingemisches in einem pH-Gradienten wanderte jedes Protein so weit, bis es
eine Position im Gel erreichte, wo der pH-Wert seinem pI entsprach. Mit der isoelektrischen Fokussierung
konnte man Proteine trennen, deren pI-Werte sich nur um 0,01 unterschieden.
Zur Herstellung von Proteinproben aus Zellkulturen wurden die Zellen mit 10 µl/cm 2 Lysispuffer
(7M Harnstoff; 2M Thioharnstoff; 1% [v/v] DTT; 2% [w/v] CHAPS; 0,8% [v/v] Pharmalyte; pH 3-10) lysiert,
mit einem Zellschaber homogenisiert und in ein Reaktionsgefäß überführt. Um im Proteinextrakt die
Aktivität von Proteasen zu hemmen, wurde PMSF bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben.
Im Anschluss erfolgte der Aufschluss der Zellen durch sechsmalige Exposition mit Ultraschallwellen für
jeweils 30 sec mit ~100 W. Zwischen den Beschallungen wurden die Zellen für jeweils 30 sec auf Eis
gestellt. Schließlich wurde der Proteinextrakt für 5 min bei 16000 g zentrifugiert, um unlösliche Materialien
abzuzentrifugieren. Schließlich wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß pipettiert Zur
Herstellung von Proteinproben aus rek. Proteinen (4.36) erfolgte die Dialyse nicht gegen 1x PBS, sondern
gegen Lysispuffer. Nach Herstellung der Proteinproben wurde die Proteinkonzentration photometrisch
bestimmt (4.37). Die Extrakte konnten bei -20°C aufbewahrt werden.
Mit der IEF-Cell wurden 17 cm lange IPG-Streifen prozessiert, die vor Beginn der Fokussierung
rehydratisiert wurden. Dazu wurden 330 µl Rehydratisierungslösung (8 M Harnstoff; 10 mM DTT; 0,5%
[w/v] CHAPS; 0,25% [v/v] Pharmalyte; pH 3-10) in die Mitte einer Vertiefungen des Kunststoffeinsatzes
der IEF-Cell pipettiert und die IPG-Streifen mit der Gelseite nach unten hinein gelegt. Im Anschluss
erfolgte die Rehydratisierung für 12 h bei 30-50 V und 0,05 mA/IPG-Streifen. Dann wurden 100-250 µg an
Protein seitlich in die Aussparungen der Kunststoffzelle appliziert. Um die IPG-Streifen vor Austrocknung
bzw. der Auskristallisation des Harnstoffs zu schützen, wurde eine ausreichende Menge an Silikonöl auf